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目的:本课题首先对四种不同品种石斛茎叶的黄酮类和多糖成分进行对比,并优选黄酮类成分最丰富的叠鞘石斛叶筛选其抗氧化部位,以期寻找叠鞘石斛叶抗氧化活性的物质基础,为天然抗氧化剂的研究开发提供依据,为资源的有效整合和利用奠定科学的基础。进一步针对目前对不同石斛的成分研究大多都是建立在干品基础上的现状,对多糖含量较高的铁皮、叠鞘石斛鲜、干品糖类部位进行对比研究,为石斛鲜品的进一步开发研究与临床使用提供理论依据。方法:(1)分别采用超高效液相色谱(Ultra performance liquid chromatography,UPLC)-二极管阵列检测器(photo diode array,PDA)法和苯酚硫酸法测定四种不同品种石斛(铁皮、金钗、束花、叠鞘石斛)茎、叶黄酮类成分和总多糖含量;(2)采用UPLC-PDA色谱法对叠鞘石斛叶黄酮类成分进行“点-线-面”质量分析。对10批叠鞘石斛叶指纹图谱进行全成分分析及相似度评价;建立同时测定芹菜素-6,8-二-C-葡萄糖苷、异夏佛塔苷、芦丁含量的方法并测定总黄酮的含量。以抗氧化活性为指标对叠鞘石斛叶进行提取工艺筛选,得到的提取物用不同极性溶剂进行萃取,分别得到石油醚层、二氯甲烷层、乙酸乙酯层、正丁醇层和水层,并对各部位进行成分分析,利用灰色关联度对各部位进行相关性分析。(3)参考药典对干品的测定法,采用切片烘干法对鲜石斛药材进行水分测定并与之相比较;分别采用不同抗氧化方法测定铁皮、叠鞘石斛鲜、干品多糖的羟基自由基清除能力、总抗氧化能力及还原力。(4)分别采用液相色谱衍生化法、扫描电镜仪、流变仪对铁皮、叠鞘石斛鲜、干品多糖成分、显微结构、流变学性质进行分析。(5)采用噻唑蓝(MTT)法分别测定铁皮、叠鞘鲜、干品石斛多糖对小鼠腹腔单核巨噬细胞(RAW264.7)及鲜品对脂多糖(LPS)诱导下RAW264.7巨噬细胞的细胞存活率;采用中性红法测定细胞的吞噬能力。结果:(1)测得四种石斛品种叶中黄酮含量明显高于茎,其中,叠鞘石斛叶的黄酮含量最高,可达2%以上;四种石斛品种茎中多糖含量均高于叶,其中,铁皮石斛茎多糖含量最高,可达25%以上;叠鞘石斛多糖含量次之,可达约10%;(2)采用UPLC-PDA色谱法同时测定叠鞘叶子中芹菜素-6,8-二-C-葡萄糖苷、异夏佛塔苷、芦丁及总黄酮的含量,方法学考察符合测定标准。指纹图谱共标定出29个峰,其中25个黄酮峰,23个共有峰;同种产地样品相似度为0.968～0.995。相对于云南叠鞘石斛叶子,产地四川的黄酮类成分更多,芹菜素-6,8-二-C-葡萄糖苷含量较低,但芦丁、总黄酮含量更高。抗氧化活性部位筛选后,发现正丁醇层和水层总黄酮量较高,多糖量较高,为抗氧化主要活性部位,这是黄酮类、多糖等成分共同协同作用的结果。(3)鲜药材的水分测定中,两种方法结果相对偏差低于5%,而药典方法只针对干品,相比之下,切片烘干法更加快速、简便。在多糖的抗氧化指标测定中,两种石斛鲜、干品多糖均有一定程度的抗氧化能力,其中,在清除羟基自由基能力(0.8～4.0 mg/mL)和还原能力(0.1～0.9 g/mL)方面,叠鞘石斛鲜品多糖活性较佳;在总抗氧化能力(3.0～7.0 mg/mL)方面,鲜品多糖活性比干品多糖更高。(4)液相色谱衍生化法:检测出甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖4种单糖组成成分;铁皮石斛多糖中测得的甘露糖含量高于叠鞘石斛;鲜品多糖中甘露糖含量和纯度略高于干品。扫描电镜结果:相比于干品多糖,鲜品多糖表面更光滑,结构更膨松。流变学性质:多糖溶液属于剪切稀化的假塑性流体,溶液黏度呈浓度依赖性;酸碱性对石斛多糖影响较大,酸性条件下铁皮石斛鲜品多糖结构最稳定,极碱性条件下(pH=13),铁皮、叠鞘石斛鲜、干品多糖结构均被破坏。(5)在313～1000μg/mL浓度范围内,铁皮、叠鞘石斛鲜品多糖对RAW264.7巨噬细胞均无抑制作用;在6.25～125μg/mL浓度范围内,鲜品多糖能在一定程度上降低LPS对细胞的抑制作用、增强细胞的吞噬能力。结论:(1)建立的UPLC-PDA及“点-线-面”质量分析方法专属性强、准确度高,用于作为黄酮大类成分的含量测定方法,更有利于石斛药材的质量监控。黄酮类成份含量最高为叠鞘石斛叶,多糖含量较高为铁皮石斛和叠鞘石斛茎。(2)叠鞘石斛叶抗氧化活性部位筛选结果表明叠鞘石斛叶可作为食品和治疗中的新型植物抗氧化剂,从中筛选抗氧化活性强的萃取层,进一步提取抗氧化活性强的化合物,为叠鞘石斛叶的综合开发利用奠定坚实的基础。(3)确定切片烘干法作为鲜药材水分测定的方法;在不同的抗氧化活性指标中,两种石斛多糖在清除羟基自由基能力方面表现更好,另外,叠鞘石斛多糖鲜品抗氧化能力相对较强,为以叠鞘石斛鲜品多糖为有效成分的天然抗氧化剂产品开发提供一定的指导依据。(4)铁皮、叠鞘石斛鲜、干品多糖具有的剪切稀化流变学行为能为石斛多糖在食品领域的研究与开发提供参考。此外,铁皮石斛鲜品多糖在酸性下结构稳定,其黏性有利于形成胃部保护膜,石斛本身具有益胃生津作用,后续将进一步挖掘鲜品多糖对胃部的疗效,为研究开发关于胃部疾病方面的辅助药物作指导。(5)铁皮、叠鞘石斛鲜品多糖对RAW264.7巨噬细胞具有免疫调节作用,对LPS诱导下的巨噬细胞损伤具有保护作用,能促进细胞的吞噬能力。不同石斛鲜、干品多糖之间的药理活性差异可能是多糖组成结构、显微结构差异等造成的结果,有待进一步考察。