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异位表达多能性因子诱导产生多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）技术为体细胞重编程研究开辟了一条新的途径,不仅可避免伦理争议-,还为干细胞及再生医学研究提供了新的研究方法。此外,iPSCs技术也是研究基因表达调控、蛋白质相互作用、机体生长发育的重要手段。目前,有关人的iPSCs研究已经取得许多进展,但对体细胞重编程机理尚不完全了解,离应用还有一定距离,仍需利用动物模型进行更深入的研究。兔的iPSCs在形态上与人iPSCs类似,这使得兔iPSCs相关研究成为关注的热点。本研究采用四环素（Doxycycline,DOX）诱导型的慢病毒载体携带Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc4个多能性转录因子,将仔兔皮肤成纤维细胞（REFs）重编程为诱导多能干细胞（RiPSCs）,并对内源多能性因子表达及细胞多能性进行分析,并利用雷帕霉素（Rapamycin）调控细胞自噬,观察其对诱导体细胞重编程效率及相关基因表达的影响,以便为提高RiPSCs重编程效率、改善RiPSCs细胞状态奠定基础。1、兔iPSCs的诱导:通过慢病毒感染方法,将携带Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 4个转录因子的病毒转入REFs并加入DOX诱导其表达。结果发现,诱导2天后,细胞形态开始出现变化,一周后形成克隆。RiPSCs克隆边缘整齐、折光性强、与周围细胞界限明显,细胞排列紧密、核质比增加。形成的RiPSCs克隆碱性磷酸酶（AP）检测结果为阳性;RT-PCR结果显示其表达内源性的Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog基因;细胞免疫荧光检测结果表明,形成的RiPSCs克隆表达Oct4、Sox2、Stat3、Sseal,未检测到E-cadherin表达。挑取了约150株克隆进行传代培养,有6株可传至20代以上并保持原有的克隆形态及多能性。2、细胞自噬调控对iPSCs诱导过程中相关基因表达及iPSCs形成的影响。探讨了不同浓度雷帕霉素处理对REFs诱导过程中自噬相关基因表达及RiPSCs形成的影响。诱导前3天添加不同浓度的雷帕霉素,待克隆形成后统计碱性磷酸酶（AP）阳性克隆数并观察克隆形态。结果发现,雷帕霉素处理的较适浓度为0.5 nmol·L-1。qRT-PCR检测结果显示,0.5 nmol·L-1雷帕霉素处理后,除了 ATG5在整个诱导过程中稳定表达之外,其余3个自噬相关基因ATG7、LC3、ULK1的表达水平在诱导过程中均有提高（P<0.05）,但升高的程度及表达时间有所不同;Oct4、Sox2、Klf4多能性基因的表达水平显著提高（P<0.05）。雷帕霉素处理后,RiPSCs的AP阳性克隆数显著增加,且克隆形态有所改善。以上结果表明,DOX慢病毒载体诱导体系可将兔成纤维细胞诱导为iPSCs,获得的RiPSCs具有多能性。调控细胞自噬可在一定程度上提高RiPSCs诱导效率。