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国内外肥胖人数激增,成为生命健康中重要的安全隐患。流行病学调查和动物实验表明,除不良饮食和生活习惯导致肥胖以外,环境内分泌干扰物（Environmentalendocrine disruptors,EDCs）暴露与肥胖具有关联性。壬基酚（Nonylphenol,NP）作为典型的EDCs,广泛存于生活环境中,通过污染食物和食物链等途径进入机体,扰乱内分泌稳态。为探究NP暴露是否导致肥胖及其可能作用关键期,本文采用体内外实验分别探讨NP暴露对大鼠致肥作用和NP对脂肪细胞分化的作用研究。第一部分 壬基酚暴露对大鼠致肥作用研究目的:探讨NP长期暴露对大鼠的致肥作用。方法:40只4周龄SD大鼠（150±10）g,雌雄各半,随机分为4组,每组10只。分别为:对照组（C组）,[低（L）、中（M）、高（H）]NP剂量组,染毒剂量为0、0.02、0.2、2μg/(kg·day-1)。定期监测大鼠体重,持续染毒26周进行剖杀取材。取腹主动脉全血得血清,全自动生化仪检测血清中脂质总胆固醇（Total cholesterol,TC）、甘油三酯（Triglyceride,TG）、高密度脂蛋白胆固醇（Hight density lipoprotein cholesterol,HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C）水平;ELISA法检测OD值计算血清中脂代谢蛋白[脂肪酸合成酶（Fatty acid synthetase,FAS）、调控脂肪细胞分化的关键基因转录调节因子（CCAAT enhancer binding protein Alpha,CEBPα）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Peroxisome Proliferators-activated receptorγ,PPARγ）、转录因子固醇结合蛋白1（Sterrol regulatory element-binding protein factor 1,SREBP1）]含量;取性腺旁脂肪垫称重后以计算脂肪脏器系数;脂肪组织HE染色后,镜下观察病理变化并进行脂肪细胞计数;用高效液相色谱法（High performance liquid chromatography,HPLC）检测其中NP含量;取适量脂肪组织100 mg提取蛋白/RNA进行蛋白印迹法实验（Western Blot,WB）/实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（Quantitative real-time reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）实验,检测脂肪组织中脂代谢（CEBPα、FAS、PPARγ、SREBP1）和凋亡[B淋巴细胞癌-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein,bax）、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3（Cysteiny1 aspartate specific protein-3,caspase-3）]相关目的蛋白/目的基因的表达水平。结果:1.大鼠NP暴露1-17周,大鼠体重有增高趋势,但无统计学差异;NP暴露21-26周随着NP剂量的增加大鼠体重呈现出C组<L组<M组<H组的变化趋势（P均<0.05）;2.大鼠暴露NP后脂肪重量/脂肪系数(F脂肪重量=103.605;F脂肪系数=169.807,P<0.001)随NP暴露剂量的增加而增加;3.各染毒组脂肪组织中NP含量高于对照组,染毒浓度越高,组织中NP蓄积量越高（F=561.353,P<0.001）;4.NP暴露组血脂（TC、TG、LDLC）含量均高于对照组(FTC=3.798;FTG=14.117;FLDL-C=4.946,P<0.05);5.脂肪组织HE染色,200倍镜下观察到对照组脂肪细胞排列整齐、大小均匀,中、高剂量组脂肪细胞面积逐渐增大,且部分细胞膜破裂,经镜下细胞计数发现,对照组的细胞数明显多于NP,随NP剂量的增加,镜下细胞数减少（F=85.873,P<0.001）;6.血清中脂代谢相关蛋白含量增加(FCEBPα=189.104;FFAS=51.011;FPPARγ=114.306;FSREBP1=30.432,P<0.001);7.NP暴露组脂肪组织中脂代谢相关蛋白（CEBPα、FAS、PPARγ、SREBP1）和凋亡相关蛋白（bax、caspase-3）表达增加(FCEBPα=53.403;FFAS=295.249;FPPARγ=169.936;FSREBP1=213.586;FBax=245.707;FCaspase-3=87.711,P<0.001);8.NP暴露组脂肪组织中脂代谢相关mRNA（CEBPα、FAS、PPARγ、SREBP1 mRNA）和凋亡相关mRNA（bax、caspase-3 mRNA）相对表达量增加(FCEBPα=101.086;FFAS=439.600;FPPARγ=10.540;FSREBP1=123.499;Fbax=31.758;Fcaspase-3=42.238,P<0.001)。结论:1.2μg/kg/day NP暴露21周可导致大鼠肥胖,主要表现为体重、脂肪重量/脂肪系数、血脂增加;2.大鼠NP暴露后血清中脂蛋白含量和脂肪组织中脂代谢（FAS、CEBPα、PPARγ、SREBP1）蛋白/RNA的表达水平异常;3.NP暴露诱发大鼠肥胖同时导致脂肪组织凋亡蛋白表达增加。第二部分 壬基酚促进3T3-L1前脂肪细胞分化的研究目的:探讨壬基酚对3T3-L1前脂肪细胞分化影响的关键期。方法:将3T3-L1前脂肪细胞培养至接触抑制后,NP暴露48h后运用噻唑蓝[Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide,MTT]法测其细胞活力,计算半数最大抑制浓度（half maximal inhibitory concentration,IC50）确定NP暴露浓度;根据MDI诱导方案将细胞NP暴露时间分为MDI诱导前（诱导前期）、MDI诱导时（诱导中期）、MDI诱导成熟脂肪细胞（诱导后期）,NP暴露时间均为48 h。倒置相差显微镜观察细胞状态和分化情况;将各组细胞经油红O染色后在倒置相差显微镜下观察脂质沉积;蛋白印迹法检测细胞中脂代谢相关蛋白（CEBPα、FAS、PPARγ、SREBP1）和凋亡相关蛋白（bax、caspase-3）表达情况。结果:1.通过MTT比色法测细胞活力计算得出NP对3T3-L1前脂肪细胞IC50为40μM,由此确定NP暴露剂量为0、40 p M、40 n M、40μM。2.NP暴露3T3-L1前脂肪细胞（诱导前期）发现,视野内油红染色程度加深,其中NP（40 p M、40 n M）油红染色主要集中在细胞膜部位;NP40μM时细胞内出现红染色。NP暴露组细胞内脂代谢相关蛋白（CEBPα、FAS、PPARγ、SREBP1）和凋亡相关蛋白（bax、caspase-3）表达增加（FCEBPα=517.864;FFAS=124.005;FPPARγ=286.338;FSREBP1=1640.631;Fbax=220.050;Fcaspase-3=1199.542,P<0.001）。3.在3T3-L1前脂肪细胞经MDI诱导时暴露NP48 h后持续培养12 d（诱导中期）,油红O染色可见暴露NP后脂滴增多增大,NP（40μM）时,视野内分化细胞数明显高于对照组,且脂滴明显增多增大;NP暴露组细胞内脂代谢相关蛋白明显高于对照组（FCEBPα=539.103;FFAS=715.740;FPPARγ=114.783;FSREBP1=139.600;Fbax=54.329;Fcaspase-3=449.201,P<0.001）。4.成熟脂肪细胞暴露NP 48 h（诱导后期）,经油红O染色发现,与对照组比较NP暴露可使细胞内红染程度稍有增加。细胞内脂代谢相关蛋白（CEBPα、FAS、PPARγ、SREBP1）和凋亡相关蛋白（bax、caspase-3）表达均稍有增加（FCEBPα=29.727;FFAS=20.609;FPPARγ=330.951;FSREBP1=27.093;Fcaspase-3=15.490,P<0.001;Fbax=4.686,P=0.008）。结论:1.NP可促进3T3-L1前脂肪细胞分化,引起细胞脂代谢和凋亡相关蛋白表达增加;2.NP促进脂肪分化关键期是MDI诱导分化前期和MDI诱导分化期,且随NP暴露剂量增加,细胞分化程度增加。