孤啡肽在大鼠神经痛及针刺镇痛中作用及机制研究孤啡肽(orpahanin FQ/nociceptin, OFQ)是1995年发现的阿片肽家族的成员,是阿片受体样受体(opioid receptor-like 1 receptor, ORL1)的内源性配体。它是一种17肽(FGGFTGARKSARKLANQ),分子量为1810,一级结构与强啡肽A较为相似。OFQ与μ,δ,κ等经典阿片受体的亲和力很低,也不能使之激活,而与ORL1亲和力很高并使之激活。OFQ及其受体广泛分布于中枢神经系统,参与痛觉调制、内分泌、免疫、心血管等多种生理活动。在痛觉调制中,脑内OFQ与脊髓OFQ的作用不同。大量研究表明脑内OFQ致痛敏并对抗吗啡镇痛,而脊髓OFQ产生镇痛作用并能加强吗啡镇痛。在炎症痛大鼠模型上,我室以往研究显示,鞘内注射OFQ能抑制福尔马林所致的痛敏。神经痛作为临床上常见的一种慢性病理性疼痛,能引起中枢神经系统的可塑性变化。OFQ作为阿片肽家族的成员之一,在神经痛过程中发生怎样的变化尚不清楚。我室采用坐骨神经慢性限制性损伤(chronic constriction injury, CCI)致神经痛大鼠模型(用4-0羊肠线对大鼠坐骨神经松扎4道,形成限制性损伤,术后3天开始出现热痛敏,7天以后趋于稳定,并能持续4周以上,是一种国内外普遍运用的神经痛动物模型),初步研究提示,鞘内注射OFQ能抑制神经痛大鼠的痛敏现象,但具体机制不清。此外,大量的实践表明,针刺镇痛是一种有效的镇痛方法,在临床上被广泛应用。针刺对于慢性神经痛(例如坐骨神经痛)有良好的疗效。多年来对针刺镇痛的机理研究表明,针刺是通过激活机体内源性痛觉调制系统,如阿片肽系统而起镇痛作用的。那么OFQ在针刺治疗神经痛时扮演怎样的角色、发挥什么作用呢?因此,探讨OFQ在大鼠神经痛及针刺镇痛中的作用是本课题研究的目的。本课题拟在以往实验的基础上,进一步揭示脊髓OFQ对神经痛大鼠的镇痛作用,研究脊髓OFQ在电针镇痛中的作用,观察神经痛及电针治疗神经痛时脊髓及脑内OFQ及其受体发生的变化。神经痛过程中,中枢神经系统发生可塑性变化,其中谷氨酸系统活性增高是引起神经痛大鼠痛敏的一个重要因素。有实验表明cAMP依赖的蛋白激酶(PKA)参与神经痛过程,那么OFQ镇痛的细胞内机制是否通过cAMP-PKA途径目前尚<WP=7>不清楚。因此,探索OFQ与谷氨酸系统之间的相互关系,初步揭示OFQ作用的细胞内信号转导途径是本课题的另一研究内容。总之,本课题拟在CCI神经痛大鼠模型上,从行为学到形态学等不同方面,从在体到离体等不同水平,采用原位杂交、免疫组化、荧光双标及Western-Blot等分子生物学技术,观察OFQ和电针对神经痛大鼠的镇痛作用,研究OFQ及其受体在神经痛及针刺镇痛中的变化,初步揭示OFQ的作用机制以及细胞内信号转导途径。实验结果如下:脊髓OFQ在大鼠神经痛及电针镇痛中的作用1.1 鞘内注射OFQ对神经痛大鼠痛阈的影响神经痛大鼠坐骨神经结扎术后第7天,分别于鞘内注射3, 10, 30 μg OFQ,给药后0,10,20,30,60,90 min测痛,观察抬脚潜伏期(paw withdrawal latency, PWL)的变化。结果显示:OFQ可剂量相关地提高神经痛大鼠痛阈,有明显的镇痛效应。1.2 鞘内注射 [Nphe1]nociceptin(1-13)NH2及nocistatin对神经痛OFQ镇痛作用的影响神经痛大鼠坐骨神经结扎术后第7天,分别于鞘内注射10 μg OFQ,10 μg OFQ受体拮抗剂[Nphe1]nociceptin(1-13)NH2,10 μg OFQ+10 μg [Nphe1]nociceptin(1-13)NH2,10 μg OFQ功能性拮抗剂nocistatin,10 μg OFQ+10 μg nocistatin,生理盐水,给药后0,10,20,30,60,90 min测痛,观察PWL变化。结果显示:OFQ受体拮抗剂对神经痛大鼠痛阈无明显影响,但能阻断OFQ对神经痛大鼠的镇痛作用。同样nocistatin对神经痛大鼠痛阈也无明显影响,但也能阻断OFQ对神经痛大鼠的镇痛作用。1.3 鞘内注射[Nphe1]nociceptin(1-13)NH2及nocistatin对电针镇痛作用的影响神经痛大鼠术后第7天给予电针30 min,观察PWL变化。结果显示:电针能明显减轻神经痛大鼠痛敏。电针前5 min分别于鞘内注射10 μg [Nphe1]nociceptin(1-13)NH2及10 μg nocistatin,给药后0,10,20,30,60,90 min测痛,观察PWL变化。结果显示:[Nphe1]nociceptin(1-13)NH2能部分阻断电针<WP=8>对神经痛大鼠的镇痛作用,nocistatin也能部分阻断电针对神经痛大鼠的镇痛作用。1.4 鞘内注射OFQ对电针镇痛作用的影响神经痛大鼠术后第7天,鞘内注射OFQ,同时给予电针30 min,给药后0,10,20,30,60,90 min测痛,观察PWL变化。结果显示:OFQ能加强电针对神经痛大鼠的镇痛作用。小结:鞘内注射OFQ对神经痛大鼠有镇痛作用,且呈剂量相关性。OFQ受体拮抗剂及功能性拮抗剂均能阻断OFQ的镇痛作用,提示鞘内注射OFQ通过其受体发挥镇痛作用。电针的镇痛作用能被OFQ受体拮抗剂及功能性拮抗剂部分阻断,且能被OFQ加强,提示电针可能通过脊髓OFQ系统发挥镇痛作用。脊髓OFQ及其受体在大鼠神经痛及电针治疗神经痛时的可塑性变化CCI神经痛大鼠术后第7天及给予电针后,观察脊髓背角OFQ及其受体表达的变化。实验分三组:正常组(Normal),神经痛组(NP),电针组(EA)。2.1 脊髓背角ppOFQ mRNA在大鼠神经痛及给予电针后的变化三组大鼠术后第7天灌注,取脊髓腰膨大段进行冰冻