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骨具有修复再生的独特能力,这归于一系列控制骨愈合的细胞和分子参与了这个复杂的过程并调控骨骼的生长和发育。骨修复中的一个重要组成部分就是骨细胞的行为。骨这种本身存在的紧密耦合对骨骼系统的正常功能及维持至关重要。骨骼系统的主要功能包括:1.提供对器官组织的支持2.调节造血系统。骨的改建与重构过程主要由两个主要类型的细胞即成骨细胞所带来的骨形成和破骨细胞造成的骨降解而完成的。这个过程正是由这些细胞的发展和激活所紧密调节的;当然,也是由一个复杂的信号网络通路所参与介导的。目前,已经被证明ERK通路、OPG/RANKL通路、BMP-2/Smads通路和Wnt信号等多个信号转导途径在整个成骨细胞分化增殖过程中都起着重要的作用。但由于这个过程本身较为复杂,所以具体的调控机制还不是十分明确。近年来在骨代谢方面,尤其是神经分泌的神经递质信号对成骨细胞的影响成为了研究热点,这为我们研究骨的生长发育、修复、以及相关疾病的治疗带来了新的方向。CGRP受体属于G蛋白偶联家族成员,是由七个跨膜结构域蛋白即降钙素受体样受体(CRLR)和辅助蛋白,受体活性修饰蛋白(RAMP1)。此外,CGRP受体组分蛋白(RCP)作为胞浆蛋白,似乎是有效的信号转导所需要的信号。而CGRP正是能激活这种受体相关的异三聚体的蛋白。进一步的证据表明CGRP在骨中起着重要作用能影响成、破骨细胞的功能。体内试验发现,在转基因小鼠成骨细胞过表达CGRP能够使骨密度增加。此外,在各种成骨细胞系及正常人成骨细胞样细胞上均发现CT和CGRP及其受体的mRNA的表达。CGRP还能促进成骨细胞增殖以及胰岛素生长因子(IGF)的表达。研究发现,CGRP能通过其受体受体刺激c-AMP活性和磷脂酶分别刺激活化蛋白激酶A(PKA),并增加细胞内游离钙的水平以及蛋白激酶C(PKC)激活。我们此次研究首先关注了CGRP受体所介导的诱导成骨分化的功能,明确CGRP在促进骨修复中的涉及的相关机制,同时也初步探索了在炎症性骨疾病中CGRP潜在的保护作用,以期为CGRP的在骨创伤愈合中的临床应用奠定基础。在研究CGRP受体所介导的诱导成骨分化的功能的试验中,我们首先利用慢病毒载体的构建,稳定敲除了cgrp受体ramp1的表达,荧光定量pcr,wb,以及免疫荧光检测敲除ramp1后对cgrp受体表达的影响。我们又通过细胞增殖测定,骨分化标志基因的表达的检测和茜素红染色等方法,检测了敲除ramp1后对cgrp诱导成骨细胞活性和分化的影响。结果表明,在成骨细胞中敲除ramp1会导致crlr表达和在细胞膜分布的抑制。此外,ramp1的稳定敲除会抑制cgrp诱导的细胞增殖和碱性磷酸酶活性,会减少runx2和i型胶原的mrna的表达以及矿化沉积。我们还发现,敲除ramp1会抑制cgrp刺激的成骨细胞c-amp的水平。此外,在本次实验中,我们还首次探讨了cgrp对于lps诱导成骨细胞凋亡的影响。同时,我们也在动物实验中对此进行了验证,并探讨cgrp在lps诱导的大鼠实验性牙周炎模型牙周组织中的作用及相关机制。方法:实验一(1).用不同浓度的cgrp处理mg63细胞1,4,7天后,采用cck-8法检测cgrp对成骨细胞增殖活性的影响。检测发现,与对照组相比,cgrp能够显著增加成骨细胞的增殖活性,且最佳浓度在10-8m。此外,alp活性也被检测。不同剂量的cgrp处理mg63细胞在成骨诱导培养基诱导1,4,7天,茜素红进行矿化结节的染色。(2).稳定转染慢病毒以敲除ramp1的表达,转染后的细胞(con-shrna,shramp1)的细胞用荧光定量pcr、westernblot及免疫荧光染色检测ramp1其他cgrp受体的蛋白和基因水平表达变化和膜分布的变化。(3).cck-8法检测con-shrna组,shramp1处理组的细胞增殖活性。接下来,成骨细胞的分化也同样用alp检测。qpcr检测成骨细胞的分化标志物runx2和collageni表达。(4).转染后,细胞内camp水平的变化被检测。cck8检测加入camp/pka信号的激动剂forskolin后的con-shrna组、shramp1处理的细胞的增殖活性。此外,还检测了alp活性以及runx2和collagenimrna水平,最后进行了各组的茜素红染色。实验二(5).我们首先检测了用不同浓度(0-1000ng/ml)lps作用于mc3t3-e1细胞48h的细胞活性。同时,也检测了cgrp的处理对mc3t3-e1细胞活性的影响。(6).用或无100nmcgrp预处理mc3t3-e1细胞30min,再用lps处理48h,流式细胞仪分析检测了CGRP对LPS诱导的MC3T3-E1细胞凋亡的影响。与此同时,我们还用Western blot检测了CGRP对LPS刺激的Caspase-3剪切蛋白表达的影响。(7).Western blot检测了CGRP对LPS刺激的ERK信号活化的影响(8).Micro-CT扫描检测牙周炎模型骨破坏程度,BVF值进行定量分析骨吸收程度。HE染色检测炎性细胞浸润;免疫组化染色检测牙周组织细胞凋亡及caspase 3剪切和ERK的表达。总结:(1).CGRP促进成骨细胞的细胞活性和成骨分化能力。(2).RAMP1的表达可以抑制CRLR的表达。(3).敲除RAMP1抑制CGRP诱导的成骨细胞的活性和成骨分化能力。(4).敲除RAMP1抑制CGRP调节的分化是通过cAMP/PKA信号途径。(5).CGRP显著刺激增加成骨细胞的活力以剂量依赖的方式,具有最佳在10 nM。CGRP可以缓解LPS对细胞活力的抑制且浓度为100nM,而不是10nM。(6).CGRP抑制LPS诱导的成骨细胞的凋亡。(7).CGRP抑制LPS诱导的成骨细胞p-ERK表达。(8).CGRP抑制LPS诱导的细胞凋亡和牙周炎模型中的骨破坏。