脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)诱导蛋鸡肠道损伤的机制研究

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脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON),是由禾谷镰刀菌和粉红镰刀菌等产生的一种真菌毒素,主要污染小麦、玉米及燕麦等粮食作物,很容易在人类的食物和动物的饲料中出现,并随着食物链进入机体消化道中,从而使肠道成为DON攻击的第一靶标。肠道是机体抵御外界病原体和毒素入侵的第一屏障,对保护人畜肠道健康具有重要作用。蛋鸡作为养殖业的重要组成部分,每年因真菌毒素污染造成的经济损失不容忽视。目前国内外关于DON单一毒素污染对蛋鸡毒性作用的研究报道非常少,诱导蛋鸡肠道炎症的发生机制亦无明确定论,因此,开展DON单一毒素对蛋鸡肠道健康的研究非常有必要。本研究通过给蛋鸡灌胃不同剂量DON标准品,分别从临床毒性效应、基因蛋白表达水平和肠道微生物宏基因组水平三个方面,探究了DON诱导蛋鸡肠道损伤的作用机制,本文主要研究内容和结论如下:(1)DON对蛋鸡生产性能、血液指标和抗氧化能力的影响:给蛋鸡灌胃不同浓度DON后,对生产性能、蛋品质、血常规、血液生化、抗氧化指标等进行观察和测定后,试验结果显示,与对照组相比,不同浓度DON处理组蛋白高度和哈夫单位均显著升高,白细胞(WBC)和血小板(PLT)数量均显著降低(P<0.05或P<0.01)。DON剂量为10 mg·kg-1时,与对照组相比,蛋鸡产蛋率极显著降低,血清中红细胞(RBC)数量、血红蛋白(HGB)含量和红细胞压积(HCT)极显著上升至最高(P<0.01);高于10 mg·kg-1时,与对照组相比,血清中RBC数量、HGB含量、HCT水平、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和碱性磷酸酶(ALP)活力和尿素(UREA)浓度及肝脏组织中一氧化氮(NO)和丙二醛(MDA)浓度显著提高(P<0.05或P<0.01),蛋壳颜色和肝脏组织中总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活力显著降低(P<0.05或P<0.01)。然而5 mg·kg-1组的T-AOC和SOD活力显著提升(P<0.05)。综上所述,DON会显著影响蛋鸡的凝血功能,当DON剂量达到10 mg·kg-1会显著降低蛋鸡产蛋率和蛋品质、引起肝脏和肾脏组织损伤、对肝脏抗氧化能力也具有显著的抑制作用。(2)DON对蛋鸡肠道形态结构、炎症细胞因子及紧密连接蛋白表达的影响:在第二章试验的基础上,试验结束时采集十二指肠组织样品,采用HE染色的方法观察DON对蛋鸡肠道形态组织结构的损伤,实时定量Real-time PCR方法检测细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α及紧密连接蛋白ZO-1、ZO-2和claudin-1的m RNA在肠道中表达量的变化;免疫印迹法(Western Blot)观察组织中ZO-1和claudin-1蛋白表达量的变化情况。结果显示,蛋鸡日粮中,5,10,20和50 mg·kg-1组肠道形态结构均受到损伤,且呈剂量-效应关系。当DON剂量为10,20和50 mg·kg-1时,会显著降低细胞炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-αm RNA表达水平(P<0.01),提示DON对机体产生免疫抑制。同时,10,20和50 mg·kg-1的DON还可使紧密连接蛋白ZO-1、ZO-2和claudin-1 m RNA的表达水平降低(P<0.05 or P<0.01),ZO-1和claudin-1在蛋鸡肠道的表达量显著降低(P<0.05或P<0.01),提示DON可抑制紧密连接蛋白的表达。综上,10,20和50mg·kg-1的DON会显著抑制机体的免疫功能,并通过抑制紧密连接蛋白的表达破坏肠道屏障功能,进而影响肠道免疫功能。(3)DON对蛋鸡肠道菌群的影响:在第二章试验的基础上,试验结束时采集各组新鲜粪便,直接提取DNA后,将DNA样品送上海派森诺生物科技股份有限公司测序,做菌群多样性分析。试验结果表明,与对照组相比,各试验组Chao指数和ACE指数均极显著降低(P<0.01),5,10和50 mg·kg-1各组Shannon指数也显著降低(P<0.05或P<0.01)。在目(Order)、科(Family)和属(Genus)水平上,与对照组相比,1,5和10mg·kg-1组物种数均显著降低(P<0.05或P<0.01),50 mg·kg-1组无显著变化(P>0.05)。在门水平上,与对照组相比,10 mg·kg-1组拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)含量均显著提高(P<0.05),在属水平上,10 mg·kg-1组乳杆菌属(Lactobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、红球菌属(Rhodococcus)、Aeriscardovia和理研菌属(Rikenella)物种相对丰度均显著降低(P<0.05),弓形菌杆属(Arcobacter)显著提高(P<0.05)。综上,蛋鸡灌胃不同浓度DON后,可降低肠道微生物的Alpha多样性和Beta多样性,使微生物菌群丰度降低;另外,DON还会改变微生物群落结构,10 mg·kg-1DON可提高肠道菌群中致病菌的含量,降低益生菌含量,增加机体疾病易感性,降低机体免疫力,影响肠道及机体健康。
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