【摘 要】
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特发性膜性肾病（idiopathic membranous nephropathy,IMN）是一种自身免疫性疾病。IMN诊断的最主要分子标志物是抗M型磷脂酶A2受体（PLA2R）的自身抗体（anti-PLA2R）,存在于超过80%IMN患者体内,在健康人体内不存在。anti-PLA2R结合肾小球足细胞表面的PLA2R,形成原位免疫复合物,攻击肾小球足细胞,导致肾小球滤过屏障破坏,最终导致IMN。已
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特发性膜性肾病（idiopathic membranous nephropathy,IMN）是一种自身免疫性疾病。IMN诊断的最主要分子标志物是抗M型磷脂酶A2受体（PLA2R）的自身抗体（anti-PLA2R）,存在于超过80%IMN患者体内,在健康人体内不存在。anti-PLA2R结合肾小球足细胞表面的PLA2R,形成原位免疫复合物,攻击肾小球足细胞,导致肾小球滤过屏障破坏,最终导致IMN。已有研究发现IMN发病率同大气中PM2.5浓度显著相关,一直以来研究人员致力阐明人体自身免疫系统在IMN发病机制中的角色,并未建立环境污染同IMN发病机制之间的关联。多环芳烃（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs）作为PM2.5的重要有机组成成分,对肾脏具有毒性效应,PAHs易于在肾脏中尤其是足细胞基底膜部位累积,因此PLA2R是PAHs的潜在毒性靶分子。为了探究PAHs同PLA2R的相互作用,本论文构建人源PLA2R胞外结构域CTLD1的原核表达体系,筛选并表征了同CTLD1蛋白相互作用的PAHs,同时成功结晶了 CTLD1。本论文工作为揭示和认知PM2.5尤其是PAHs诱导INM发病提供了重要的科学依据。论文通过将人源PLA2R（Ncbi:NM007366.5）基因经密码子优化后连接到pET40b载体上;将带有目的基因的重组质粒转化至表达宿主Shuffle T7并低温诱导,获得可溶性蛋白DsbC-8His-CTLD1;通过镍柱亲和层析与凝胶过滤层析得到纯度95%的DsbC-8His-CTLD1融合蛋白;使用人源肠激酶hEK-6His切除DsbC融合标签进一步纯化后得到CTLD1,纯度95%以上;MALDI-TOF MS测得CTLD1实际分子量为17199 Da,与理论值相符。同时构建pET28a-CTLD1-6His原核表达载体经过同样诱导条件获得可溶CTLD1-6His;经色谱纯化、质谱表征,得到了纯度95%以上的CTLD1-6His。利用圆二色谱（CD）分析CTLD1以及CTLD1-6His,两者CD谱图一致,说明在没有DsbC（促二硫键异构酶）存在条件下,CTLD1仍能够以天然构象在大肠杆菌中可溶表达。对CTLD1进行变温圆二色分析,确定Tm为52℃。利用等温滴定量热实验筛选了与CTLD1存在相互作用的共10种PAHs:其中,苯并[a]蒽、苯并[a]芘、苯并[b]荧蒽、芘能够结合CTLD1,结合能力由强到弱依次为:苯并[a]蒽>苯并[a]芘>苯并[b]荧蒽>芘。进一步利用圆二色分析共孵育CTLD1与PAHs溶液发现:苯并[a]蒽、苯并[a]芘、芘与CTLD1的结合影响了CTLD1二级结构。最后,为解析CLTD1的X射线晶体结构,筛选并确定了 CLTD1晶体培养条件为:CLTD1蛋白浓度11 mg/mL,25℃0.075MNa2HPO4,0.075 M K2HPO4,0.075 M MES pH=6.5。综上,论文研究实现了 PLA2R部分胞外结构域在原核体系下的高效表达,通过等温滴定量热技术筛选并表征了与CTLD1蛋白相互作用的PAHs,同时获得CTLD1蛋白质晶体。
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