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目的NLRP3(NOD-like receptor family,pyrin domain-containing3)炎症小体与多种炎症性疾病相关,本研究采用脂多糖(LPS)诱导的小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)NLRP3炎症小体激活作为体外炎症模型。在细胞水平上,研究酸性鞘磷脂酶抑制剂丙咪嗪(imipramine)对LPS诱导的RAW264.7细胞NLRP3炎症小体激活的抑制作用,并探讨酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase,ASM)/神经酰胺(ceramide,Cer)通路在NLRP3炎症小体激活机制中的作用,进一步为炎症性相关疾病的预防和治疗提供新靶点和新的思路。方法1利用LPS诱导的RAW264.7细胞NLRP3炎症小体的激活作为体外炎症模型。2用不同浓度的丙咪嗪(0、20、40、60、80、100μmol/L)与外源性C2-神经酰胺(0、10、20、30、40、50μmol/L)处理细胞24小时,通过CCK-8法检测不同浓度的丙咪嗪与C2-神经酰胺对RAW264.7细胞活性的影响。3用不同浓度的丙咪嗪预先处理RAW264.7细胞2小时,再与1 mg/L LPS共同作用8小时后,应用Western blot法检测RAW264.7细胞中ASM、NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表达情况;运用Elisa法检测RAW264.7细胞上清液中炎性细胞因子IL-1β和IL-18的释放水平。4用不同浓度的丙咪嗪预先处理RAW264.7细胞2小时,再与1 mg/L LPS共同作用8小时后,应用细胞免疫荧光法检测RAW264.7细胞中Cer含量的变化。5用不同浓度的外源性C2-神经酰胺处理RAW264.7细胞8小时,应用Western blot法检测RAW264.7细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表达水平。结果1 CCK-8法检测不同浓度的丙咪嗪与外源性C2-神经酰胺对RAW264.7细胞活性的影响结果显示,丙咪嗪浓度范围在0~60μmol/L与C2-神经酰胺浓度范围在0~30μmol/L时,对RAW264.7细胞无明显毒性,其细胞活力相比与空白对照组无显著性差异。2与对照组相比,LPS可以在蛋白水平显著增加RAW264.7细胞中ASM、NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的表达(P<0.01);然而,给与丙咪嗪预处理可显著抑制细胞中ASM、NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白表达,呈现一定的剂量依赖性(P<0.01)。3与对照组相比,LPS可显著增加RAW264.7细胞上清液中IL-1β和IL-18的释放水平(P<0.01);然而,给与丙咪嗪预处理可显著抑制细胞上清液中IL-1β和IL-18的释放(P<0.01)。4在荧光显微镜下,与对照组相比,LPS能显著增强RAW264.7细胞内的荧光强度,然而丙咪嗪可抑制这种荧光增强。通过定量的分析发现,与对照组相比,LPS处理可导致RAW264.7细胞中Cer的生成增加(P<0.01),而给与丙咪嗪预处理可显著抑制由LPS诱导Cer的生成,且随着丙咪嗪浓度的增加抑制趋势越明显(P<0.01)。5与对照组相比,外源性C2-神经酰胺明显增加RAW264.7细胞内NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表达,且随着神经酰胺浓度增大,呈现剂量-反应关系,与对照组相比,差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论丙咪嗪作为酸性鞘磷脂酶的抑制剂可显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中ASM蛋白的表达,ASM作为调控Cer生成的关键酶,ASM蛋白表达的降低进一步抑制了Cer的生成;结合丙咪嗪对LPS诱导的RAW264.7细胞中NLRP3炎症小体的激活具有明显的抑制作用以及外源性C2-神经酰胺可激活RAW264.7细胞中NLRP3炎症小体,可以表明ASM/Cer通路在NLRP3炎症小体形成和活化中起关键作用;丙咪嗪作为酸性鞘磷脂酶的抑制剂可通过对ASM/Cer通路的调控进而抑制NLRP3炎症小体的激活并起到抗炎作用。