功能DNA具有选择性好、易于合成等特点,本论文主要通过对功能化DNA结构设计与微流控技术联用等方法构建生物传感器,并应用于疾病标记物以及环境污染物等的分析检测中。本论文主要分为以下六章:第一章,重点介绍功能化DNA生物传感器的基本概念和本质特点,对各类型功能化DNA生物传感器进行了分类介绍。并对微流控技术的基本概念和工艺流程进行简单概述。同时对功能化DNA生物传感器在便携检测中的研究与运用进行了介绍。最后对本论文的研究目的和主要内容进行简要的说明。第二章,基于金属有机骨架MOF材料对DNA探针的吸附作用以及蛋白质分子对DNA的末端保护作用,构建了一种荧光生物传感器用于检测H5N1抗体。首先在单链DNA-5’端修饰上FAM荧光基团作为荧光信号探针。引入MOF材料进入反应体系,DNA荧光探针被吸附在MOF材料上并导致FAM基团荧光猝灭。随后,ExoI酶参与反应对DNA探针的3’端进行特异性的酶解,使得探针被水解并释放出FAM基团,荧光得到恢复。靶标H5N1抗体通过DNA探针3’端的H5N1抗原特异性识别与结合实现对DNA探针3’端的末端保护,当靶标存在的情况下,ExoI无法酶解DNA探针并释放FAM基团,荧光信号无恢复;反之,荧光信号恢复增强。H5N1抗体浓度负对数值与荧光信号之间呈线性关系,其线性范围为1.0 × 10-6mol/L到5.0 × 10-9mol/L的工作曲线,检测限为1.6 × 10-9mol/L(S/N = 3)。该生物传感器成功应用于血清样品H5N1抗体的检测。第三章,利用不同长度的DNA序列与带有负电荷ITO电极表面的静电排斥作用的差异构建了一个简易、灵敏且免修饰的均相反应电化学检测体系,用于DNA甲基化的检测和相关抑制药物的筛选。首先在接近DNA甲基化回文序列的DNA-3’端核苷酸上标记上电化学活性物质(亚甲基蓝),并自杂交形成茎环结构DNA探针,在没有DNA甲基化的情况下,亚甲基蓝标记的电化学活性片段无法被Dpn I酶解释放,使得在DNA探针上亚甲基蓝由于静电作用远离了 ITO电极表面,产生微弱的电化学响应信号。反之,在DNA回文序列被甲基化后,DpnI酶会特异性地识别酶解DNA甲基化位点,使得亚甲基蓝标记的电化学活性片段被分离释放。由于DNA短链片段带有较少的电荷,其与ITO电极的静电排斥较小,可以自由扩散到电极表面,所以获得较强的电化学响应信号。基于此可以实现DNA甲基化的定量电化学检测。本体系无需复杂的样品前处理过程,如重亚硫酸亚处理、PCR扩增或者电极表面修饰等。六个平行检测通道被设置在同一个微芯片上实现了单一样品的多次平行检测并提高了药物筛选的效率。此检测平台可方便快捷地特异性监测DNA甲基化水平,并具有良好的灵敏度和选择性。对于临床检测,该体系能用于甲基转移酶的抑制类药物筛选,具有较好的应用前景。第四章,基于靶标响应DNA水凝胶集成的微流控纸芯片分析装置(μPAD),通过靶标调控流体的滞留和流动建立了一个通用的即时检测实验平台,并实现了多靶标的同时检测。在μPAD上,适配体交联的DNA水凝胶作为靶标特异性识别的调控器控制着流体的流动状态。在没有靶标存在的情况下,水凝胶会在纸芯片通道中逐渐形成,阻止样品流体的持续流动,使得流体无法流动到显色信号区,即无变色的可视化信号输出。反之,在靶标存在的情况下,由于靶标与适配体链的特异性结合,使得DNA水凝胶无法稳定的形成,样品流体可以通过纸芯片毛细作用不断的向前流动,直至最终抵达显色信号区,即肉眼可见变色可视化信号输出。μPAD廉价且易于制备,便携易用,检测完后还可一次性抛弃,环保可降解。仅通过装样操作即可实现6分钟后的信号读取,无需任何辅助仪器协同检测。多种靶标,如可卡因,腺苷和Pb2+等可实现同时检测,即便在复杂生物体系(尿液等)中也能稳定工作。该体系提出了一种简易、廉价、快速、用户友好型的即时检测方法,具有较好的实际应用价值。第五章,基于淀粉酶包埋的适配体交联水凝胶,通过靶标特异性识别释放淀粉酶引发串联酶催化反应,实现响应信号放大与微流控纸芯片装置(μPAD)的便携读取。随着靶标的加入,水凝胶会瓦解并释放淀粉酶,淀粉酶水解样品液中的淀粉产生大量的葡萄糖。再折叠μPAD进行上样,含有葡萄糖的样品液通过毛细作用平行扩散到μPAD的各个检测区进行显色反应。即葡萄糖与检测区预先填充好的葡萄糖氧化酶(GOx)和辣根过氧化物酶(HRP)串联酶催化共反应,促使KI变色产生棕色碘单质。不同浓度靶标产生的显色程度不同,最终实现裸眼定量信号输出及手持仪器辅助定量分析。分别在缓冲液和尿样中完成了可卡因的快速检测,证实了酶包埋水凝胶联用μPAD的可行性和实用性。腺苷的通用性检测论证了酶包埋水凝胶识别体系联用μPAD具有广泛应用价值,构建了普适性较好的便携检测新平台。第六章,基于微流控距离读取纸芯片标尺,协同靶标响应的酶包埋DNA水凝胶建立了无仪器辅助、便携可抛的可视化定量通用检测平台(μDiSH-PAD)。通过DNA适配体水凝胶的特异识别机制,靶标响应解胶,释放酶催化剂引发串联酶解信号放大反应,最终在μDiSH-PAD上实现可视化距离读取定量检测。酶包埋DNA水凝胶由适配体连接触发交联反应,淀粉酶包埋成胶。当靶标存在的情况下,水凝胶瓦解释放淀粉酶,催化样品中的淀粉产生大量葡萄糖,再与μDiSH-PAD上的葡萄糖氧化酶(GOx)和辣根过氧化物酶(HRP)共反应催化显色底物二氨基苯甲胺(DAB),最终形成特定距离的棕色聚合物条带poly(DAB)。从而建立起靶标浓度与条带距离的正相关性,实现了靶标的可视化定量检测。本章以可卡因作为模板实现了 μDiSH-PAD对可卡因的高特异、高灵敏定量分析。水凝胶识别与酶包埋机制为体系提供了广泛的靶标适用性和信号扩增作用。作为廉价易用、通用性强且便携可抛的纸芯片微装置,μDiSH-PAD在环境监测、家庭健康看护,临床诊断等领域具有极大的开发潜力和广泛的应用价值。