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人体各组织器官均存在活性氧代谢的动态平衡系统，以稳定机体内环境，当这种平衡状态被打破，将发生氧化应激反应。已知机体许多疾病的发生发展均直接或间接的与氧化应激有关，如缺血再灌注损伤、神经退行性疾病、衰老、心血管疾病、高血压、糖尿病、关节炎和肿瘤等。为抵抗氧化应激引起的损伤，细胞在进化过程中逐渐形成防御能力，其中，Keap1-Nrf2-ARE是细胞抗氧化应答中重要的信号转导通路。而Keap1是调控核转录因子Nrf2活化的关键因素，它的开启或关闭，将调控Nrf2介导抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶基因的表达。生理条件下，Keap1与Nrf2结合，将Nrf2固定在细胞骨架上，抑制Nrf2活性。在轻度氧化损伤或应用抗氧化剂时，能够促使Keap1-Nrf2复合体解离，Nrf2迅速易位入核，与ARE结合，诱导Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的基因表达，清除细胞内过量的ROS，避免氧化应激损伤发生。 然而，组织细胞的抗氧化应激能力是有限的，应用抗氧化剂预防或治疗氧化损伤尤为重要。白藜芦醇(3，4，5-trihydroxystilbene;Resveratrol)是一种存在于葡萄和红酒中的天然多酚类化合物，具有明显的抗氧化作用，深受医学和药学研究者广泛的关注。研究表明:白藜芦醇主要是通过促进Nrf2易位入核，与ARE结合，上调Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶活性表达，发挥清除亲电子物和氧化物，避免氧化应激损伤组织细胞的作用。本课题组在研究白藜芦醇抗氧化损伤作用中发现:白藜芦醇能够使UVA辐射的HacaT细胞内Keap1蛋白含量明显减少，提示白藜芦醇可能具有促进Keap1蛋白降解的作用，但白藜芦醇促进Keap1蛋白减少的分子机制尚不完全清楚。研究表明组织细胞内蛋白降解的可能途径包括泛素化后经蛋白酶体降解，溶酶体途径降解等;另外，在抑制蛋白转录和翻译过程中发挥重要作用的microRNA亦受到研究的广泛关注。microRNA是一类内源性非编码RNA，通过与靶基因mRNA特异性的碱基互补配对，引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻译。microRNA几乎参与体内所有的基本的信号转导途径，调节人类近1/3的基因表达。最近有研究报道，microRNA-200a可以与Keap13非翻译区(3UTR)上相应靶序列互补结合，从而影响Keap1mRNA水平。 为此本研究重点关注白藜芦醇调节Keap1蛋白的分子机制，应用培养的MDA-MB-231细胞，分别利用5μmol/L和20μmol/L的白藜芦醇处理培养细胞24h和48h，免疫荧光染色法显示Keap1在细胞的表达;Westernblot方法检测各组细胞Keap1和Nrf2的表达。另外，同样条件处理HacaT、HepG2细胞，进一步验证白藜芦醇对不同种类细胞Keap1的作用。为探讨白藜芦醇调控Keap1蛋白的可能途径，本实验在白藜芦醇处理细胞的同时，应用泛素-蛋白酶体抑制剂MG-132、溶酶体稳定剂氯喹处理24h，Westernblot方法检测MDA-MB-231细胞Keap1蛋白量。最后，应用RT-PCR和qPCR法检测白藜芦醇处理的MDA-MB-231细胞中Keap1mRNA和microRNA-200a的表达量，为阐明白藜芦醇的抗氧化作用分子机制及其临床应用提供新的实验依据。 主要结果如下: 1.白藜芦醇调节Keap1和Nrf2蛋白含量研究:免疫荧光染色可见，Keap1主要存在于细胞质内，白藜芦醇处理组的Keap1荧光强度明显减弱;Westernblot结果表明，与对照组相比，随白藜芦醇作用时间延长(24h、48h)和药物浓度的增加（5μmol/L、20μmol/L），Keap1蛋白含量逐渐减少，呈时间和浓度依赖性。同时，与对照组相比，白藜芦醇组Nrf2含量相应增加，表明白藜芦醇能增加细胞内Nrf2的量，这一作用可能是通过促进细胞质内Keap1蛋白含量降低，增加了Nrf2的稳定性。 2.白藜芦醇使Keap1蛋白减少的机制研究:本研究采用泛素-蛋白酶体抑制剂MG-132处理，分别应用MG-132浓度(10μmol/L、20μmol/L)预处理2h或6h，与对照组相比，白藜芦醇作用后Keap1蛋白含量仍明显减少。应用稳定溶酶体酶药物（氯喹）抑制溶酶体功能，与对照组相比，加入白藜芦醇后Keap1含量仍明显减少，表明Keap1蛋白减少与上述蛋白降解途径无关。 3.microRNA-200a参与白藜芦醇引起的Keap1蛋白减少:与对照组相比，RT-PCR结果显示白藜芦醇对Keap1mRNA量有所增加，但WB显示Keap1蛋白却明显减少;有趣的发现是:白藜芦醇处理组细胞内microRNA-200a随药物浓度（5μmol/L、20μmol/L、50μmol/L）增加而表达增加，有显著差异。 结论: 本研究表明:天然抗氧化剂白藜芦醇具有提高机体组织细胞抗氧化能力，其可能机制为:白藜芦醇或其代谢产物能够促使Keap1蛋白降解，使Keap1含量下降，增加Nrf2的稳定性，有利于Nrf2转位入核与ARE反应元件结合，激活Keap1-Nrf2-ARE信号转导分子。白藜芦醇的这种抗氧化应激作用主要是使细胞内Keap1蛋白减少，这种减少不依赖于泛素-蛋白酶体和溶酶体途径，可能与microRNA-200a表达增高抑制Keap1mRNA翻译有关，详细机制仍有待今后进一步研究。