论文部分内容阅读
第一部分AMPKα是否参与细胞内DNA双链断裂修复过程[目的]研究AMPKα是否参与卵巢癌细胞DNA双链断裂修复。[方法]本部分实验分为以下5部分:1.X射线处理人卵巢癌细胞SK-OV-3和HO-8910以及人乳腺癌细胞诱导DNA双链断裂后,分离细胞染色质组分,利用蛋白免疫印迹方法检测诱导前后AMPKα在染色质组分中的水平;2.构建GFP-AMPKα1,GFP-AMPKα2及包含GFP-AMPKα1不同结构域质粒,并将其转染至人骨肉瘤细胞U2OS内。激光处理癌细胞后,观察GFP融合蛋白是否能被招募至激光诱导的DNA损伤位点处;3.将GFP-AMPKα1转染至人骨肉瘤细胞U2OS中,后分别使用ATM抑制剂KU-55933和PARP抑制剂ABT-888分别处理细胞,激光处理定点诱导DNA双链损伤,荧光显微镜下观察AMPKα1的招募情况;4.构建GFP-AMPKα1,Flag-SBP-AMPKα1,Flag-PARP1和HA-PARP1 4种质粒,分组转染至人胚胎肾细胞HEK293T细胞内,分别使用X射线和H2O2处理细胞造成DNA双链断裂后收集蛋白样品,免疫共沉淀实验检测DNA损伤后AMPKα1和PARP1之间的相互作用;5.使用不同浓度的博来霉素（BLM 0μM,2μM,4μM,6μM,8μM,10μM）处理人卵巢癌细胞SK-OV-3 2h诱导DNA损伤,48h后利用CCK8试剂盒检测SK-OV-3细胞存活率。取药物半致死浓度处理人卵巢癌细胞SK-OV-3 2h后换正常培养基让细胞修复,并在不同时间点收集蛋白样品,利用蛋白免疫印迹方法检测不同时间点AMPKα蛋白和磷酸化水平。[结果]1.X射线处理不同癌细胞系后,蛋白印迹检测到AMPKα在DNA双链断裂产生后在染色质组分中的水平增加;2.激光造成卵巢癌细胞DNA双链断裂后,观察到AMPKα1和AMPKα2蛋白均能被招募至DNA损伤处,且AMPKα1的催化结构域主要介导了AMPKα1蛋白的募集;3.PARP抑制剂ABT-888处理引起AMPKα1蛋白在DNA断裂位点的招募受损,而ATM抑制剂KU-55933不影响这一过程;4.免疫共沉淀实验结果显示,DNA损伤可增加PARP1和AMPKα1之间的相互作用;5.根据CCK8细胞存活实验结果确定SK-OV-3细胞中BLM的半致死浓度为3.3μM。使用BLM4μM处理卵巢癌细胞2h后,免疫印迹检测到AMPKα磷酸化水平显著升高。[结论]AMPKα的两个亚型AMPKα1和AMPKα2均能定位到DNA双链断裂位点处。PARP1处在AMPKα1上游,调控其被招募至DNA损伤位点,且AMPKα1 N端的催化结构域对此招募过程至关重要。AMPKα的磷酸化形式可能参与调控DNA损伤应答修复。第二部分PRKAA1基因敲除对卵巢癌细胞DNA双链断裂修复功能的影响[目的]构建PRKAA1敲除细胞系,探索PRKAA1基因敲除对卵巢癌细胞DNA双链断裂修复的影响。[方法]本部分实验分为以下3部分:1.利用CRISPR-Cas9技术在在人卵巢癌细胞SK-OV-3和人宫颈癌细胞He La中分别敲除AMPKα1蛋白编码基因PRKAA1;2.BLM 4μM同时处理对照组和敲除组2h后更换培养基让细胞修复,在不同时间点收集蛋白样品,蛋白免疫印迹检测ATM和H2AX磷酸化水平,免疫荧光观察比较两组H2AX磷酸化水平差异;3.在敲除细胞内回转GFP-AMPKα1,BLM 4μM同时处理对照组,敲除组和敲除后恢复AMPKα1表达组2h后更换培养基让细胞修复,并在不同时间点收集蛋白样品,蛋白免疫印迹检测AMPKα1回转是否能挽救相关表型。[结果]1.利用蛋白免疫印迹方法明确敲除效果,在人卵巢癌细胞SK-OV-3和人宫颈癌细胞He La内分别成功敲除PRKAA1;2.蛋白免疫印迹结果显示,与对照组相比,敲除组ATM和H2AX磷酸化水平显著降低,说明ATM激酶激活过程受阻,DNA双链断裂修复能力降低。进一步,免疫荧光结果显示,DNA双链断裂后,敲除组H2AX磷酸化水平较野生组显著降低;3.与敲除细胞组相比,回转GFP-PRKAA1使癌细胞ATM磷酸化水平上升,DNA双链断裂修复能力提高。[结论]敲除PRKAA1致卵巢癌细胞DNA双链断裂修复能力受损,激酶ATM活化过程受阻,而恢复AMPKα1蛋白表达能挽救这一现象。第三部分AMPKα1参与DNA损伤修复的分子机制[目的]研究AMPKα1影响ATM激活的分子机制。[方法]本部分实验分为以下2部分:1.将GFP-N1,GFP-AMPKα1和GFP-AMPKα1分别转染至3皿HEK293T内,第三组使用10μM BLM处理3h造成细胞DNA双链断裂,第一组和第二组均使用等量DMSO处理3h作为对照,收集蛋白样品进行免疫共沉淀实验,后跑SDS-PAGE凝胶银染并利用质谱技术鉴定AMPKα1的相互作用蛋白;2.将Flag-AMPKα1和GFP-Artemis,GFP-AMPKα1以及Flag-AMPKα1三组分别转染至HEK293T内,并转染相应的空载体作为对照组,ICRF或BLM 10μM处理3h造成细胞DNA双链断裂后收集蛋白样品,免疫共沉淀实验检测AMPKα1是否与双链修复相关蛋白Artemis、BRCA1以及RAD50相互作用。[结果]1.银染结果显示,10μM BLM处理后,与AMPKα1相互作用的蛋白较未处理组显著增多。随后对质谱鉴定到的蛋白进行生物信息学分析,发现AMPKα1与诸多参与DNA损伤修复密切相关的蛋白有UBR5,PARP1,RAD50,BRCA1/2和Artemis等;2.免疫共沉淀实验发现AMPKα1与双链修复相关蛋白Artemis,BRCA1以及RAD50相互作用。[结论]免疫共沉淀结合质谱技术鉴定发现AMPKα1可与多个参与DNA损伤修复通路的蛋白相互作用,这些蛋白包括RAD50,BRCA1和Artemis等。