【摘 要】
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炎症是机体应对组织损伤或外来病原体入侵产生的应激反应,应激失衡会导致机体损伤,甚至引发严重的疾病。在应对饥饿、物理或化学刺激时,机体会通过自噬作用维持机体平衡。川陈皮素是一种多甲氧基黄酮,广泛地存在于柑橘属植物的果皮中,具有显著的抗炎、抗氧化以及抗癌等生物活性。本研究采用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导小鼠巨噬细胞（Raw264.7）产生炎症反应,研究川陈皮素诱导的自噬与
【基金项目】
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国家自然科学基金（31972070;31571836）；
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炎症是机体应对组织损伤或外来病原体入侵产生的应激反应,应激失衡会导致机体损伤,甚至引发严重的疾病。在应对饥饿、物理或化学刺激时,机体会通过自噬作用维持机体平衡。川陈皮素是一种多甲氧基黄酮,广泛地存在于柑橘属植物的果皮中,具有显著的抗炎、抗氧化以及抗癌等生物活性。本研究采用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导小鼠巨噬细胞（Raw264.7）产生炎症反应,研究川陈皮素诱导的自噬与抗炎作用间的关系。本研究的主要内容及结论如下:（1）川陈皮素对LPS诱导的Raw264.7细胞炎症反应的影响。首先通过MTT实验明确川陈皮素对Raw264.7细胞的无毒性剂量范围。实验结果表明,80μM以内的川陈皮素对Raw264.7的毒性作用不显著（P＞0.05）。因此,选取10μM、25μM、50μM的川陈皮素进行后续实验。通过Gressis试剂法分析了川陈皮素对一氧化氮（nitric oxide,NO）产生的影响;通过RT-PCR以及Western blot,分析各处理组中诱导型一氧化氮氧合酶（inducible nitric oxide synthase,i NOS）及环氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）的表达。结果表明,川陈皮素在LPS诱导的炎症反应中具有显著的抗炎效果。（2）川陈皮素在LPS诱导的Raw264.7细胞炎症反应中对自噬的影响。采用单丹磺酰尸胺（monodansylcadaverin,MDC）荧光染色分析自噬泡的产生,通过RT-PCR及Western blot分析川陈皮素对自噬相关基因以及LC3和P62蛋白表达的影响。上述研究表明:川陈皮素处理后,自噬泡的数量呈剂量依赖性增多;自噬标志蛋白LC3II呈剂量依赖性显著上升（P＜0.05）,自噬的作用底物蛋白P62呈剂量依赖性下降（P＜0.05）;且0.5μg/m L LPS+25μM川陈皮素处理组与0.5μg/m L LPS处理组相比,自噬基因表达量也明显增加（P＜0.05）。结果表明,川陈皮素能够呈剂量依赖性上调自噬通量。（3）川陈皮素诱导的自噬与抗炎作用间的关系。本实验采用30μM氯喹（chloroquine,CQ）预处理1h抑制自噬,分析该处理对炎症因子i NOS和COX-2表达的影响。结果表明,与0.5μg/m L LPS+25μM川陈皮素处理组相比,0.5μg/m L LPS+25μM川陈皮素+30μM CQ处理组中促炎因子的基因及蛋白表达量均显著上升（P＜0.05）,这表明川陈皮素可能通过上调自噬发挥抗炎作用。（4）川陈皮素对IL-6/STAT3/FOXO3a信号通路的影响。Western blot分析表明,与0.5μg/m L LPS处理组相比,25μM川陈皮素+0.5μg/m L LPS处理组中的IL-6及P-STAT3蛋白表达量显著下降（P＜0.05）,细胞核中P-FOXO3a的表达量明显增多（P＜0.05）,细胞浆中的P-FOXO3a显著减少（P＜0.05）;25μM川陈皮素+0.5μg/m L LPS+30μM CQ处理组与25μM川陈皮素+0.5μg/m L LPS处理组相比,IL-6、P-STAT3及细胞核内的P-FOXO3a的含量明显增多（P＜0.05）,表明川陈皮素可能通过抑制IL-6及其下游P-STAT3的表达,促进P-FOXO3a从细胞质转移进入细胞核,进而上调自噬;使用自噬抑制剂CQ处理后阻断了溶酶体对IL-6、P-STAT3及P-FOXO3a等通路蛋白的降解,使这些蛋白在细胞内累积。本研究表明,川陈皮素可能通过IL-6/STAT3/FOXO3a途径呈剂量依赖性上调自噬,进而发挥抗炎作用。
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