论文部分内容阅读
膀胱癌是一种发生在膀胱粘膜表面的恶性肿瘤,属于泌尿系统中最常见的恶性肿瘤类型,被认为是一种高免疫原性的癌症类型,相较与其它类型的癌症具有更高的突变率。由于膀胱癌的早期诊断会提升患者的生存率,因此医学上也迫切需要基于尿液的生物标志物用于无创性诊断膀胱癌。尿膀胱癌抗原(Urinary bladder cancer antigen;UBC)是膀胱癌标志物中的典型一种,属于一类分泌于尿液中的细胞角蛋白片段,在泌尿上皮癌中有较高表达,目前检测UBC含量的方法均具有一定的局限性,存在检测方法敏感性低、操作繁琐、价格昂贵等现实问题,因此创建一种低成本,强特异性,高灵敏度的新型生物检测方法来解决当下的燃眉之急。首先本研究以UBC为靶点蛋白,利用噬菌体展示技术进行了四轮筛选,成功获得与UBC特异性结合的特异性噬菌体,对噬菌体进行结合活性检测、ss DNA提取、测序、翻译及多肽序列对比,确定了三条目标配体序列。然后通过分子模拟对接技术,对三条配体序列的三维结构进行模拟,并借助分子对接模拟软件进行模拟结合位点分析以及评测,最终将得到多肽与靶蛋白位置上的结合模拟成像,筛选其中的两条多肽序列,并将两条序列进行了生物膜干涉实验,挑选亲和力最高的一段序列并合成,即:K-H-F-T-H-N-H-H-P-I-T-W,利用细胞免疫荧光实验鉴定了该多肽与人膀胱癌细胞具有较强的结合,正常细胞和其他癌细胞中没有荧光信号。最后通过该多肽配体与表面增强拉曼散射(Surface-Enhanced Raman Scattering,SERS)技术相结合,将银纳米粒子(Ag NPs)作为免疫探针和磁珠多肽探针对UBC抗原进行夹心检测,建立了UBC抗原的表面增强拉曼散射的检测方法,实现了对临床尿液样本的定量检测,UBC检出限LOD=6.25μg/L,按临床阈值10μg/L标准,6例临床尿液检测与临床病理诊断结果符合率100%。本研究基于UBC的特异性配体肽,初步建立了表面增强拉曼散射的新方法。为UBC的快速检测提供了低成本、高特异、高灵敏的新手段,也为肿瘤标志物的临床检测方法提供了新思路。