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背景与目的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是引起慢性肝炎、肝硬化、肝癌的主要原因之一,全世界已有近3.5-4亿人成为慢性HBV携带者。我国是HBV感染的中高流行区,2006年的血清学调查结果表明我国一般人群HBsAg携带率为7.18%,有近3000万慢性乙型肝炎患者。目前,依据全基因序列异质性差异≥8%或S区基因序列差异≥4%,将HBV分为A—H8种基因型,其中A基因型又分为两种亚型:Aa型(a代表Asia)和Ae型(e代表European);B基因型分为Ba型(a代表Asia)和Bj型(j代表Japan)两种亚型;C基因型分为C1、C2两个亚型。近年来的研究表明HBV基因型与传播方式、疾病进展、预后以及临床抗病毒疗效等均有一定的相关性。为了解中国北方地区HBV基因型及亚型在终末期肝病病人中的分布情况,本研究采用基因型及亚型特异引物的巢式聚合酶链反应检测了101例肝硬化患者和178例原发性肝癌患者的HBV基因型及基因亚型分布,并结合临床资料分析HBV基因亚型与终末期肝病的相关性,以进一步明确不同HBV基因型致肝脏损害的差异。材料与方法1.选取2007-2008年北方地区HBV DNA阳性的肝硬化和原发性肝细胞癌住院患者共279例。其中包括155例新鲜肝脏组织标本和124例血清标本。2.核酸提取酚-氯仿抽提法分别提取血清和组织中的HBV-DNA。3.行巢式聚合酶链反应对HBV-DNA进行分型。4.使用2%的琼脂糖凝胶进行电泳。以2000DL分子量标准的Marker,作为分子量对照。5.凝胶成像,并通过产物片段的大小来判断基因型(部分样本进行前S/S区以及X区的基因测序,以验证确定基因型)。6.数据分析采用SPSS13.0统计软件进行统计,两均数比较使用t检验,率的比较采用卡方检验,多个样本的比较采用非参数检验。P＜0.05时认为有统计学意义。结果1.将PCR产物在2%琼脂糖中进行电泳,根据PCR产物片段大小能清晰直观地辨别出HBV的基因型及亚型。随机选取部分样本进行前S/S区以及X区的基因测序,测序分型结果与PCR基因分型结果的符合率为100%,证实了此方法的特异性和准确性。2.PCR结果显示,在101例肝硬化患者中,分型结果为Ba亚型的1例(0.99%),C2亚型94例(93.07%),Ba、C2混合型6例(5.94%)。在178例原发性肝癌患者中,分型结果为Ba亚型的6例(3.37%),C2亚型159例(89.33%),Ba、C2混合型13例(7.30%)。两组患者中均未检测到其他基因型。统计结果表明,两组的基因型均以C2型为主,Ba、C2亚型在肝硬化和肝癌患者中的分布无显著性差异(P＞0.05)。3.肝硬化与肝癌患者的男女构成比有显著性差异(P＜0.05),男性在肝癌患者中所占比例大于在肝硬化患者中所占比例。各基因亚型感染患者中男性均多于女性,C2型肝硬化和肝癌患者的男女构成比有显著性差异(P＜0.05)。肝硬化与肝癌患者的年龄分布无显著差异(P＞0.05)。经Kruskal-Walls检验,各种基因亚型在肝硬化患者和肝癌患者中的年龄分布无差别(P＞0.05)。4.各种基因型HBeAg阳性率在肝硬化患者和肝癌患者中均无显著性差异(P＞0.05),但肝癌患者中HBeAg阳性率明显低于肝硬化患者(P＜0.05)。5.肝硬化和肝癌患者的TBIL水平有显著性差异(P＜0.05),但不同基因亚型肝硬化患者、肝癌患者中TBIL的水平无显著性差异(P＞0.05)。肝硬化和肝癌患者的ALT水平无显著性差异(P＞0.05),各种基因亚型在肝硬化患者或肝癌患者中的ALT水平无显著性差异(P＞0.05)6.通过比较49对癌组织、癌旁组织HBV基因亚型的分布,发现有3对配对标本的基因型不同,其中癌组织均为C2型,癌旁组织均为Ba、C2混合型。结论1.本研究结果显示肝硬化和肝癌组病例均以C基因型感染为主,B型次之。基因亚型分析结果进一步表明,所有C型标本均为C2亚型,所有B型标本均为Ba亚型,而BC混合型标本都为Ba亚型和C2亚型混合感染。2.肝硬化和肝癌患者中各基因型及亚型的分布无显著性差异,而肝硬化及肝癌患者中的C基因型分布则显著高于慢性乙型肝炎患者。表明C基因型的HBV感染所导致的肝病病情较重,进展较快,进一步证实HBV基因型与疾病的进展预后具有相关性。3.B、C基因型肝硬化和肝癌组患者男、女构成比均无明显差异。提示不同基因型男性和女性HBV感染者发生肝硬化以及肝癌的可能性与HBV基因型无关。4.有3对配对组织的基因分型结果不同(经测序证实)。是否提示肝癌发生的单细胞克隆特性有待进一步验证。