1.研究背景当下癌症已经成为人类致死的重要因素之一,已经严重威胁到人类的身心健康。与发达国家相比,我国肿瘤发病率高且有逐年上升的趋向。目前,药物化疗、放疗和手术治疗是临床上治疗肿瘤的主要手段,即便它们在治疗癌症过程中发挥了至关重要的作用,但是在药物治疗肿瘤过程中容易出现耐药性,毒副作用等不良反应,而且制药成本也逐渐增高,因此探求新型的特异性抗肿瘤药物的任务显得尤为迫切。近来年传统中药越来越受到人们的关注,因其毒副作用小,价格低廉,来源广泛,种类繁多等优势。冬凌草甲素是从唇形科植物中分离提取的一种无色棱柱状结晶,无色,味苦,不溶于水的贝壳杉烯二萜类天然化合物。冬凌草甲素对多种肿瘤细胞如胰腺癌、宫颈癌、肝癌等多种肿瘤细胞有明显的抑制作用。尽管目前人们对冬凌草甲素抗癌作用及其抗癌作用机制研究展开了大量的研究,但其作用于肿瘤细胞的信号路径及其特点仍有许多未解之处,不能有效安全的为临床用药提供指导。本文运用现代分子生物学技术进一步揭示冬凌草甲素作用于肿瘤细胞的机制,进一步为临床用药提供理论依据。2.研究目的研究冬凌草甲素诱导HepG₂肝癌细胞凋亡及其相关信号通路3.研究方法3.1冬凌草甲素浓度从低到高作用于HepG₂肝癌细胞24h后,MTT法检测冬凌草甲素对该肿瘤细胞的抑制率及其生长曲线;结晶紫法观察药物作用细胞数量的变化3.2不同浓度冬凌草甲素作用HepG₂肝癌细胞后,用流式细胞仪检测冬凌草甲素对HepG₂肝癌细胞细胞周期分布的影响;3.3 Western blotting检测不同药物浓度的冬凌草甲素作用于HepG₂后ATR和P-ATR、ATM和P-ATM、CHK1和P-CHK1、Cdk1和P-Cdk1、、H2AX和γ-H2AX、CDC25C和P-CDC25C等与细胞周期引起凋亡相关蛋白的表达影响。4.结果4.1 MTT法检测结果显示:低浓度冬凌草甲素对肝癌HepG₂细胞抑制作用较弱,高浓度冬凌草甲素对肝癌HepG₂细胞抑制作用较强,抑制率呈剂量依赖性;结晶紫法显示:冬凌草甲素药物浓度越高,结晶紫染色越少,细胞存活率越低,存活细胞数量越少。4.2流式细胞仪检测显示:冬凌草甲素阻滞HepG₂肝癌细胞于G2/M期,冬凌草甲素药物浓度越高,HepG₂肝癌细胞处于G2/M期的数量越多。4.3 Western blotting检测技术检测冬凌草甲素对HepG₂肝癌细胞相关蛋白显示:不同浓度的冬凌草甲素作用HepG₂肝癌细胞24h后,其Western印迹结果表明,随着药物浓度增加,P-ATM、P-ATR、γ-H2AX、P53、Phos-P53、P-CDC25C、P-Cdk1、P-CHK1、P-CHK2蛋白在细胞体内表达增加,CDC25C,,Cdk1蛋白表达逐渐减少,Cyclin B1蛋白表达则无差别。5.结论冬凌草甲素可明显抑制HepG₂肝癌细胞增殖,其细胞IC50为:（31.92±1.8）μmol/L;冬凌草甲素在抑制HepG₂肝癌细胞生长过程中,与细胞周期密切相关,冬凌草甲素可使HepG₂肝癌细胞阻滞于G2/M期;冬凌草甲素抗HepG₂肝癌肿瘤机制可能是通过增加细胞周期相关蛋白磷酸例如P-ATM、P-ATR,P-P53、P-Cdk1、P-CDC25C等来激活细胞周期检查点来影响细胞周期进程,从而发挥对肿瘤细胞的抑制作用。