荔枝核总皂苷对Aβ1-42诱导BV-2细胞活化的抑制

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目的:研究荔枝核总皂苷对Aβ1-42诱导BV-2细胞活化的抑制作用。方法:(1)CCK-8法、酶标仪检测BV-2细胞增殖的OD值,并计算增殖相对百分率(reletive growth rate,RGR),以评价荔枝核总皂苷对BV-2细胞的安全浓度。(2)ELISA测上清液炎性因子白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)、环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2, COX-2)的含量,倒置显微镜观察BV-2细胞形态学,以此评价Aβ1-42诱导BV-2细胞活化最适浓度及荔枝核总皂苷抑制BV-2细胞活化的最适浓度和时间。(3)瑞氏-姬姆萨染色、光学显微镜观察荔枝核总皂苷抑制BV-2细胞活化的形态学变化;实时荧光定量PCR(Quantitative Rea l-time PCR)测定炎性因子IL-1β、iNOS、COX-2的基因表达;免疫印迹法(Western blot)检测IL-1β、iNOS、COX-2的蛋白表达,以评价荔枝核总皂苷对Aβ1-42诱导BV-2细胞活化的抑制作用。结果:(1)荔枝核总皂苷安全浓度:与对照组比较,7.5mg·L-1-240mg·L-1荔枝核总皂苷作用BV-2细胞24h,细胞相对增殖百分率明显降低(P<0.05);0.117mg·L-1-3.75mg·L-1荔枝核总皂苷对BV-2细胞增殖的相对百分率无影响。(2)Aβ1-42诱导BV-2细胞活化的最适浓度:与对照组比较,1.25μmol·L-1-10μmol·L-1Aβ1-42能增加BV-2细胞释放IL-1β、COX-2(P<0.05,P<0.01);0.625μmol·L-1-10μmol·L-1Aβ1-42使BV-2细胞释放iNOS增加(P<0.05,P<0.01);倒置显微镜(×200)下,对照组BV-2细胞呈圆或椭圆形、细胞突起、抱团现象较少,核规则、完整;0.625μmol·L-1-10μmol·L-1Aβ1-42组细胞数量减少、胞体膨大、形状不规则,突起明显等活化标志,其中以5、10μmol·L-1Aβ1-42最为明显。(3)荔枝核总皂苷抑制BV-2细胞活化的有效浓度及最佳时间:倒置显微镜(×200)下,对照组细胞数量较多,胞体呈圆形或椭圆形,突起少;模型组细胞数量减少、胞体膨大、形状不规则,突起明显;0.015mg·L-1-0.469mg·L-1荔枝核总皂苷加入经Aβ1-42预处理的BV-2细胞共同培养12h,可增加BV-2细胞数量,减少细胞突起、膨胀及抱团现象;0.938mg·L-1-3.75mg·L-1荔枝核总皂苷加入经Aβ1-42预处理的BV-2细胞共同培养12h及0.015mg·L-1-3.75mg·L-1荔枝核总皂苷+Aβ1-42+BV-2细胞共同培养24h均对活化的BV-2细胞形态学改变无影响。荔枝核总皂苷作用于Aβ1-42预处理BV-2细胞12h,0.059mg·L-1-0.469 mg·L-1荔枝核总皂苷可明显减少IL-1β含量(P<0.05,P<0.01);0.007mg·L-1-0.469 mg·L-1荔枝核总皂苷可明显减少COX-2含量(P<0.05,P<0.01);0.117 mg·L-1-0.469 mg·L-1荔枝核总皂苷可明显降低iNOS含量(P<0.01)。荔枝核总皂苷、Aβ1-42和BV-2细胞共同培养24h,0.015mg·L-1-0.059 mg·L-1荔枝核总皂苷可明显减少IL-1β含量(P<0.05);0.029mg·L-1、0.059 mg·L-1荔枝核总皂苷可降低iNOS含量(P<0.05),不同浓度荔枝核总皂苷对C OX-2含量影响不明显。(4)荔枝核总皂苷对BV-2活化的抑制:①光学显微镜下(×200),对照组细胞呈圆形或椭圆形,突起少,无核碎裂现象,模型组细胞膨胀变形、突起多,核碎裂明显;0.117mg·L-1-0.469mg·L-1荔枝核总皂苷组的细胞突起明显减少,膨胀变形及核碎裂现象均不明显。②与对照组比较,模型组IL-1β,COX-2,iNOS mRNA表达水平出现明显升高(P<0.01);与模型组比较,0.117mg·L-1-0.469mg·L-1均可减少IL-1β、COX-2、iNOS mRNA表达(P<0.01),但不同剂量组间比较差异不明显。③与对照组比较,模型组COX-2、IL-1β、iNOS蛋白表达的条带颜色加深、宽度增加,平均灰度值水平明显增高;与模型组相比较,0.117mg·L-1-0.469mg·L-1荔枝核总皂苷组的COX-2、IL-1β、iNOS蛋白表达的条带颜色变淡、宽度变窄,且灰度值水平明显降低(P<0.05,P<0.01)结论:(1)≤3.75mg·L-1荔枝核总皂苷对BV-2细胞无毒性,可在此浓度以下进行体外药效学实验。(2)5μmol·L-1和10μmol·L-1 Aβ1-42均可很好地诱导BV-2细胞活化。(3)荔枝核总皂苷抑制诱导BV-2活化安全有效的浓度为0.117mg·L-1-0.469mg·L-1、时间为12h。(4)荔枝核总皂苷可有效抑制BV-2细胞活化,减少炎性因子IL-1β、iNOS、COX-2的基因及蛋白表达。
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