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背景与目的脊髓损伤(SCI)目前缺乏有效的治疗手段,主要困难有:残存神经细胞的存活、轴突再生、残存轴突的再髓鞘化、再生轴突的生长方向不确定、以及如何重新构建有功能的轴突联系。SCI大部分是不完全横断损伤,但是在物理和化学作用下,局部缺血、缺氧,损伤区域可能进入多种炎性因子,细胞死亡和凋亡等级联效应被触发,可以造成残存神经系统的继发性损伤。损伤脊髓局部因此普遍存在残存轴突脱髓鞘的病理改变,有些患者在数十年后,轴突脱髓鞘变化仍然存在,使残存轴突不能发挥作用。这些不利因素一直困扰着医学工作者。在中枢神经系统发育和损伤修复过程中,作为少突胶质细胞主要来源的少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte Precursor Cells,OPCs)在一系列信号(如PDGF、netrin-1)诱导下可以迁移到相应的中枢神经系统轴突,然后分化成成熟的髓鞘少突胶质细胞,发挥中枢神经系统发育和损伤修复的功能。大量研究表明:趋化因子及其受体在肿瘤细胞和正常细胞的迁移中发挥重要作用。并且已有研究表明,CXCL12可以通过CXCR4调控OPCs的迁移、增殖和分化来促进损伤脊髓的修复和中枢神经系统的发育,但也有研究发现CXCL12/CXCR4不能调控OPCs的迁移。而在胆管癌细胞和成熟树突细胞中发现CXCL12/CXCR4可以通过AKT和MEK1/2通路调控其存活和趋化性。目前CXCL12/CXCR4对少突胶质前体细胞迁移的影响研究还远未明晰,且其机制尚不清楚。因此,本研究拟通过体外实验检测CXCL12/CXCR4对少突胶质前体细胞迁移的影响及AKT和MEK1/2通路在其中的重要角色,以期为脊髓损伤修复提供一定的实验基础。方法1.利用振荡分离和差速贴壁等方法分离、培养新生48 h的SD大鼠大脑皮层组织中的OPCs,并根据OPCs表面标记PDGFR-α及成熟少突胶质细胞标记O4、MBP三个指标进行免疫荧光实验鉴定分离的OPCs及诱导分化中期和晚期的成熟少突胶质细胞。2.通过boyden chamber小室检测在不同浓度的CXCL12(0 ng/ml、5 ng/ml、10ng/ml、20 ng/ml)作用下对大鼠OPCs处理48h后其迁移能力的变化,利用Western blotting实验检测相应条件下cxcr4及mek1/2与pi3k通路中erk、p-erk、akt和p-akt蛋白表达的变化。3.通过cxcr4shrna抑制大鼠opcs中cxcr4蛋白表达,利用westernblotting实验检测cxcl12(20ng/ml)作用条件下大鼠opcs中cxcr4及mek1/2与pi3k通路蛋白erk、p-erk、akt和p-akt表达的变化。利用boydenchamber小室检测相应条件下大鼠opcs迁移能力的变化。4.分别通过ly294002阻断pi3k通路、u0126阻断mek1/2通路、ly294002和u0126同时阻断pi3k和mek1/2通路,利用westernblotting实验检测cxcl12(20ng/ml)作用条件下大鼠opcs中mek1/2和pi3k通路蛋白erk、p-erk、akt和p-akt表达的变化,通过boydenchamber小室检测大鼠opcs迁移能力的变化。结果1.利用振荡分离和差速贴壁等方法可以大量获得原代opcs,其胞体呈近圆形,胞体周围具有纤细的两极或三极细胞突起,经免疫细胞化学检测结果显示上述方法分离的原代opcs特异性表达pdgfr-α,比例达95%。opcs经诱导成成熟少突胶质细胞后,诱导中期o4表达呈阳性,其胞体呈圆形,胞体周围纤细突起增多;诱导晚期mbp表达呈阳性,细胞周围有很多纤细的突起,向四周放射呈网状。2.opcs在不同浓度的cxcl12作用下处理48h后,随着cxcl12浓度的提高大鼠opcs的迁移能力逐渐增强,cxcl12浓度为20ng/ml时促进作用最明显(p<0.05),达到对照组的3.64倍。westernblotting实验结果显示:cxcr4、p-erk、p-akt蛋白表达随着cxcl12浓度的提高逐渐增加,cxcl12浓度为20ng/ml时增加最明显(p<0.05);而erk、akt蛋白的表达没有明显的变化(p>0.05)。3.通过cxcr4shrna抑制cxcr4蛋白表达后,与对照组相比,cxcl12(20ng/ml)对大鼠opcs迁移的促进作用受到明显抑制(p<0.05),并且pi3k和mek1/2通路蛋白erk和akt磷酸水平也受到明显抑制(p<0.05,p<0.05)。4.分别用ly294002阻断pi3k通路和u0126阻断mek1/2通路,与对照组相比,cxcl12对大鼠opcs迁移的促进作用均受到明显抑制(p<0.05,p<0.05);ly294002和u0126同时阻断pi3k和mek1/2通路后,与对照组相比,cxcl12对大鼠opcs迁移的促进作用受到更加明显的抑制(p<0.01)。结论1.本研究通过振荡分离和差速贴壁等方法可以大量获得原代opcs。2.cxcl12能够促进大鼠opcs的迁移和cxcr4、p-erk、p-akt蛋白表达,并呈浓度依赖性。3.CXCL12促进大鼠OPCs迁移和p-ERK、p-AKT蛋白表达的作用可以被CXCR4shRNA抑制。4.CXCL12促进大鼠OPCs迁移的作用可以被PI3K通路和MEK1/2通路的阻断剂抑制。因此,CXCL12/CXCR4可能通过MEK1/2和PI3K通路调控大鼠OPCs的迁移。