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绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)是一种引起山羊、绵羊、大角羊和小反刍动物传染性胸膜肺炎的主要致病菌,主要症状为咳嗽、喘息、逐渐消瘦、肺间质增生等,病程长达数月至数年,四季均可发病。国内首次从四川边区莱斯特种羊(从新西兰、英国引进)体内分离到Mo病原,并在甘肃、宁夏、内蒙、河北、新疆等多个省份先后报道了Mo感染,Mo引起的胸膜肺炎蔓延日趋严重,给养羊业造成巨大的经济损失。因此,建立一种快速、高敏的检测方法对该病的快速筛查和有效预防具有重要意义。本文从血清学和病原分子生物学两方面入手,探究了以侧向层析为基础的Mo快速检测方法。本研究表达并纯化了绵羊肺炎支原体的infA、Met、MO-1、MO-2四种原核表达蛋白,培养绵羊肺炎支原体后分别提取全菌蛋白和膜蛋白。以所有蛋白分别作为检测抗原组装捕获法胶体金试纸条:胶体金标记金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA),检测抗原包被检测线(T线),鸡抗SPA抗体包被质控线(C线)。以infA、Met、MO-1、MO-2蛋白分别作为检测抗原组装双抗原夹心法胶体金试纸条:胶体金标记检测抗原,同时检测抗原包被T线。血清样本加于试纸条上样垫,10~15 min读取结果。试纸条经测试有效后筛选检测抗原,建立Mo的胶体金免疫层析检测方法。结果显示:infA、Met重组蛋白作捕获法的检测抗原时,阳性样品结果明显,阴性样品假阳率较高,约50%。作夹心法的检测抗原时,阳性反应结果较弱,且有假阳性出现;MO-1、MO-2作捕获法的检测抗原时,阳性反应较弱,且有假阳性,与夹心法结果一致;Mo的全菌蛋白和膜蛋白作捕获法的检测抗原时,特异性较好,前者的检出率高于后者。因此,本研究以Mo的全菌蛋白作为检测抗原,初步建立了Mo的捕获法胶体金免疫层析方法,这种方法对其它病原菌感染的血清均显阴性,灵敏度为1:100,表明其特异性和灵敏度较好。没有批内差和批间差,重复性和稳定性良好。本文初步建立了Mo胶体金免疫层析方法,进一步优化后可在基层畜牧兽医站推广使用。本研究结合降落PCR(Touchdown PCR,TD PCR)和侧向层析技术(lateral flow assay,LFA)建立了Mo病原分子生物学检测方法。两条特异性引物5’端分别标记地高辛和生物素,以提取的基因组为模板进行TD PCR;胶体金标记抗地高辛抗体,检测线和质控线分别包被链霉亲和素和羊抗鼠IgG,组装成LFA方法胶体金核酸层析试纸条。将TD PCR产物滴加于核酸试纸条上样垫,在15 min内读取检测结果,通过对各环节的调整优化,建立了检测Mo核酸的TD PCR-LFA快速检测方法。结果显示:建立的TD PCRLFA方法仅对Mo病原呈阳性,其他病原菌均为阴性,表明该方法特异性良好。其检测下限为20.6 ng/ml,敏感性较强。TD PCR批间产物、批间试纸条读取结果一致,重复性和稳定性较好。本研究建立的Mo检测方法整合了TD PCR的特异性、敏感性和金标条快速、简单的特性,在2 h内可完成检测。为建立适用于基层和畜牧兽医站的病原分子学诊断方法奠定了基础。