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胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)是一种高度未分化细胞，它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官。ESCs研究的科学价值在于这种能够自我更新具有多分化潜能的干细胞，在胚胎发育、移植治疗、基因治疗以及新药开发等方面都有着广阔的应用前景，利用干细胞技术来治疗疾病将是未来医学的发展方向。Notch1基因在许多组织细胞中表达，包括中枢神经系统、胰腺、造血细胞等，它编码一种跨膜受体蛋白，参与调节各种各样细胞分化及发育的信号转导途径，并影响了多种生长发育过程。在ESCs中存在一种“旁侧抑制”即位于ESCs表面的Notch1可与邻近细胞表面的配体Delta结合，抑制其下游bHLH(basic helix-loop-helix)家族神经分化基因如Mash1、NeuroD等的转录，从而抑制ESCs向神经细胞转化。因此，当Notch1下调后，可以使ESCs从“旁侧抑制”中释放出来，进而促进ESCs向神经细胞分化。鉴于上述，本实验旨在构建特异性Notch1的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)真核表达载体抑制小鼠ESCs中Notch1基因的表达，并检测dishevelled(DVl)-1和c-jun terminal kinase(JNK)-3基因的mRNA表达变化，试图从信号转导途径分析Notch1表达受到抑制后对ESCs功能的影响。方法：1．构建Notch1基因的siRNA真核表达载体：根据GenBank提供的Notch1基因的核苷酸序列，按照Ambion公司网站的siRNA设计工具设计两对双链siRNA，先克隆入T载体，经筛选，鉴定，测序后，双酶切靶基因，再亚克隆入siRNA载体pSINsi-U6中构建重组体pSINsi-U6-1和pSINsi-U6-2，筛选，并用限制性内切酶酶切进行鉴定。2．通过脂质体Lipofectamine 2000瞬时转染小鼠ESCs 48小时，同时在瞬时转染的基础上，利用该载体带有新霉素抗性筛选系统，用G418筛选出阳性克隆，并用Real-Time PCR技术检测Notch1，Dvl-1和JNK-3 mRNA的表达。结果：1．构建了小鼠Notch1基因siRNA真核表达载体pSINsi-U6-1和pSINsi-U6-2，经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致。2．重组载体，空载体通过脂质体Lipofectamine 2000瞬时转染小鼠ESCs 48小时，Real-Time PCR检测Notch1 mRNA的表达，结果显示：未转染组和空质粒组Notch1 mRNA的表达均无明显变化，而重组载体pSINsi-U6-1和pSINsi-U6-2两组Notch1 mRNA的表达明显下调。3．pSINsi-U6-1的RNA干扰效果较pSINsi-U6-2强。4．转染后，用Real-Time PCR检测了Dvl-1和JNK-3 mRNA的表达，结果显示：Dvl-1和JNK-3 mRNA的表达均上调。结论：1．构建的小鼠Notch1基因siRNA真核表达载体pSlNsi-U6-1和pSINsi-U6-2，可显著抑制小鼠ESCs中Notch1基因的表达，从而使Dvl-1和JNK-3基因的mRNA表达水平上调。2．由Dvl-1和JNK-3两基因的mRNA表达变化可以推测在Notch1抑制后，分化的小鼠胚胎干细胞功能是受到保护的。