氨肽酶N（Aminopeptidase N,APN/CD13）在多种结肠癌、卵巢癌、乳腺癌和肺癌等多种癌细胞表面高表达，它可通过促进新生血管生成，同时降解细胞外基质等方式促进肿瘤的侵袭和转移，从而促进肿瘤的发生发展。天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸（NGR）能够特异性结合到APN/CD13上，与新生血管发生特异性结合。与NGR共轭后，能够改善抗肿瘤药物的药物疗效，同时降低药物毒性。基于这类特点，我们合成了NGR（NO2）三肽并与5-氟尿嘧啶（5-FU）结合形成5-FU的前体药-13F-1，利用体内外实验研究该药物的抗肿瘤作用及机理研究。研究目的研究5-FU前体药-13F-1抗肿瘤作用，初步探讨其作用，为药物开发和恶性肿瘤临床治疗奠定实验基础。研究方法1．13F-1在体外实验中对人结肠癌Colo205细胞的影响⑴MTT法及克隆形成实验：取对数生长期Colo205细胞分为：阴性对照组：培养基中加入不含血清的RPMI-1640培养基，分别培养24h、48h和72h；13F-1处理组：分别加入终浓度为1μM、5μM10μM、50μM和100μM的13F-1，分别培养24h、48h和72h。应用MTT法及细胞克隆形成实验评价13F-1对人结肠癌细胞Colo205的生长抑制作用。⑵取对数生长期Colo205细胞分为：阴性对照组：培养基中加入不含血清的RPMI-1640培养基，培养24h；5-FU处理组：加入终浓度为10μM的5-FU，培养24h；13F-1处理组：分别加入终浓度为1μM、5μM和10μM的13F-1，培养24h。应用Annexin/FITC染色后，利用流式细胞仪检测人结肠癌细胞Colo205细胞的凋亡。以Hoechst33342染色观察Colo205细胞凋亡形态。以JC-1探针检测Colo205细胞中线粒体膜电位的变化。以免疫荧光流式细胞仪及Western blotting检测Colo205细胞中APN的表达。2．13F-1在体内实验中对人结肠癌Colo205移植瘤裸鼠的影响⑴人结肠癌Colo205移植瘤裸鼠模型的建立：健康雌性BALB/C-nu裸鼠30只，于左前肢腋部皮下接种人结肠癌Colo205细胞，建立移植瘤裸鼠模型。将裸鼠随机分为阴性对照组、13F-1高剂量组（100mg/kg）、13F-1中剂量组（50mg/kg）、13F-1低剂量组（25mg/kg）、5-FU组（50mg/kg）。每组6只，接种24h后，尾静脉注射给药，持续三周。观察移植瘤生长情况。⑵接种后第22天处死瘤鼠，计算抑瘤率。同时，眼球取血后，利用全自动血液分析仪测定裸鼠外周血的变化。分别利用免疫组织化学和Westernblotting法检测人结肠癌Colo205移植瘤组织中APN的表达水平。以TUNEL法检测Colo205人结肠癌组织的凋亡变化。以免疫组织化学法和Western blotting检测凋亡相关蛋白的表达。利用相关试剂盒检测Colo205人结肠癌细胞及组织匀浆上清中的ROS和SOD等生化指标。以RT-PCR检测ROS来源的相关基因人NADPH氧化酶1（NOX-1）和MnSOD mRNA的表达。结果1．13F-1在体外实验中对人结肠癌Colo205细胞的影响⑴MTT法及细胞克隆形成实验：13F-1在浓度为1～100μM范围内，对人结肠癌Colo205细胞增殖产生剂量和时间依赖性（与阴性对照组相比，13F-1浓度为1μM、5μM作用24h，1μM作用24h，P>0.05；5μM作用24h，P<0.05）。统计分析结果表明，13F-1在作用时间为24h时的半数抑制浓度（IC50）为32.80±1.13μM。细胞克隆形成实验结果表明，13F-1显著抑制人结肠癌Colo205细胞克隆形成，并呈剂量和时间依赖性（与阴性对照组相比，1μM，P<0.05；5-100μM，P<0.01）。50μM和100μM的13F-1作用72h后，对细胞克隆形成的抑制率为100%。50μM的5-FU在作用48h和72h，也能完全抑制克隆形成。⑵Annexin V-FITC/PI双染检测Colo205细胞凋亡率，阴性对照组细胞凋亡很少，终浓度为1、5和10μM的13F-1作用于Colo205细胞24h后，细胞凋亡率显著升高（p均<0.05）。与阴性对照组相比，10μM的5-FU的细胞凋亡率的差异没有统计学意义。采用Hoechst33342染色后于荧光显微镜下观察人结肠癌Colo205细胞核凋亡形态，发现正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡蓝色，应用13F-1后，Colo205细胞发生凋亡，凋亡细胞的核浓集而成亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。利用JC-1检测线粒体膜电位（Δψm），结果显示1、5和10μM13F-1显著降低Colo205细胞Δψm（P均<0.05），10μM5-FU作用后，人结肠癌Colo205细胞很少发生凋亡，同时Δψm也没有显著变化。免疫荧光流式细胞仪及Western blotting检测结果表明13F-1显著降低APN的表达，与阴性对照组比较，10μM5-FU的APN表达量的变化没有显著性意义。2．13F-1在体内实验中对人结肠癌Colo205移植瘤裸鼠的影响⑴试验期间，阴性对照组裸鼠一般状态良好，未出现体重下降等现象。与阴性对照组相比，5-FU组给药后，裸鼠明显消瘦，而13F-1各剂量组裸鼠并未出现消瘦现象，与阴性对照组比较，体重无显著性差异（P>0.05）。另外，5-FU组的裸鼠外周血中的白细胞总数、中性粒细胞、淋巴细胞以及血小板计数显著性降低（P<0.05）。结果表明，13F-1的毒副作用较5-FU明显减小。⑵尾静脉注射13F-13周后，5-FU（50mg/kg）、13F-125mg/kg、50mg/kg和100mg/kg剂量组肿瘤抑制率分别为56.3%、36.1%、50.4%和63.9%（P均<0.05），50mg/kg5-FU与100mg/kg13F-1的肿瘤生长抑制率有显著性差异（P>0.05）。13F-1作用后，APN表达显著降低（P<0.05），而5-FU组对APN表达的影响没有显著性差异（P>0.05）。与阴性对照组比较，13F-1各剂量组诱导细胞凋亡，凋亡率有显著性差异（P<0.05），5-FU组对APN表达的影响没有显著性变化。同时，Western blotting结果显示，13F-1各剂量组增加人结肠癌Colo205移植瘤组织中凋亡相关蛋白cleaved-9，caleved-3和cleavedPARP的表达，同时增加Bax/Bcl-2的比例（P均<0.05），然而，5-FU组作用后，与阴性对照组比较，cleaved-9，caleved-3和cleaved PARP的表达没有显著性变化，同时Bax/Bcl-2的比例也没有显著性变化。另外，ROS含量显著性增加，SOD含量显著性降低，NOX-1mRNA表达显著性增加，而MnSOD mRNA表达显著性降低（P均<0.05）。结论小分子类肽化合物13F-1特异性结合APN，降低APN的表达，进而通过诱导ROS依赖的线粒体凋亡途径有效抑制人结肠癌Colo205移植瘤裸鼠肿瘤生长。