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寻常痤疮(acne vulgaris)是毛囊-皮脂腺单位的炎症性疾病,主要累及青少年及部分成年人,发病率高。其发病机制复杂,主要与皮脂异常分泌、毛囊皮脂腺导管异常角化、痤疮丙酸杆菌定植(Propionibacterium acnes,P.acnes)及炎症和免疫反应相关。长期以来,P.acnes被认为参与寻常痤疮发病的多个环节,在痤疮发病机制中一直受到广泛关注。近年,有研究认为NLRP3炎症小体参与痤疮炎症,例如P.acnes可通过皮脂腺细胞和单核细胞NLRP3/caspase-1/IL-1β信号通路参与痤疮炎症反应。角质形成细胞,作为毛囊皮脂腺单位的重要组成部分,与痤疮炎症密切相关,但P.acnes是否通能过活化角质形成细胞NLRP3炎症小体而参与痤疮炎症反应仍有待研究。在寻常痤疮的常见治疗药物中,抗生素、维甲酸类药物有确切疗效,国际痤疮联盟推荐的痤疮诊疗指南中将这些药物作为作为一线用药;但由于抗生素治疗所致的耐药问题日益凸显,而维甲酸类药物所致的皮肤粘膜干燥、致畸反应等副作用导致患者依从性降低,极大影响痤疮治疗效果。因此,开发安全温和且有确切疗效的抗痤疮药物势在必行。本课题旨在探讨P.acnes活化NLRP3炎症小体的可能作用机制,同时探讨PPI干预NLRP3炎症小体活化的作用研究;此外,本研究以P.acnes刺激的HaCaT角质形成细胞为靶细胞,就PPI对与痤疮炎症可能相关的TLR2-p38MAPK/NF-κB信号通路的抑制作用进行研究,为痤疮治疗开发新药提供思路。研究内容包括以下两部分:第一部分:P.acnes诱导角质形成细胞NLRP3炎症小体活化及PPI干预研究目的:探讨P.acnes活化NLRP3炎症小体的作用机制及PPI对此的干预作用方法:(1)在P.acnes菌液刺激HaCaT角质形成细胞,ELISA试剂盒检测上清液中P.acnes在不同作用时间时IL-1β、IL-8的分泌量;(2)通过qPCR和Western blot方法检测在P.acnes菌液刺激的HaCaT角质形成细胞不同作用时间时CD36、NOX1、NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2表达情况,Western blot 检测 ASC、active caspase-1、cleaved IL-1β 表达;使用 caspase-1活性试剂盒检测caspase-1活性;通过流式细胞仪检测CD36、ROS的表达;(3)分别采用siRNA干扰CD36、NOX1、NLRP3的表达,Western blot方法检测 NLRP3、ASC、active caspase-1、cleaved IL-1β 表达;(4)采用siRNA干扰CD36后,通过western blot观察NOX1表达;流式细胞仪检测ROS的表达;通过western blot方法检测NLRP3炎症小体各组分蛋白的表达;(5)通过western blot方法观察采用siRNA干扰NOX1后CD36及NLRP3炎症小体各组分蛋白的表达;通过流式细胞仪检测ROS的表达;(6)通过western blot方法观察在加入NAC、DPI后NLRP3炎症小体各组分蛋白的表达;通过流式细胞仪检测ROS的表达;(7)分别采用siRNA干扰CD36、NOX1、NLRP3表达或分别加入DPI、NAC或使用Caspase-1抑制剂预处理情况下,通过ELISA法检测不同分组细胞上清液中IL-1β和IL-8的表达;(8)加入IL-1β中和抗体及IL-1R受体阻滞剂,ELISA试剂盒检测炎症因子IL-8的分泌,明确P.acnes刺激的角质形成细胞IL-1β生成对IL-8分泌的影响作用;(9)在P.acnes菌液刺激的角质形成细胞中,根据预实验结果加入不同浓度梯度的 PPI(0.3、0.6、0.9 μg/ml),通过 western blot 检测 CD36、NOX1、NLRP3、ASC、Active Caspase-1、Cleaved IL-1β的表达,流式细胞仪检测ROS的表达、ELISA 检测 IL-1 β、IL-8 分泌。结果:(1)P.acnes能促进HaCaT角质形成细胞IL-1β、IL-8分泌,在24小时内且呈时间依赖的方式。(2)P.acnes刺激的HaCaT角质形成细胞中CD36mRNA、NOX1 mRNA、NLRP3mRNA、ASC mRNA、Active-Caspase-1 mRNA 表达上调;CD36、NOX1NLRP3炎症小体各蛋白组分和ROS表达明显上调;且在24小时内具有时间依赖性。(3)siRNA分别干扰CD36、NOX1、NLRP3的表达或加入DPI、NAC预处理后,流式细胞仪结果显示ROS表达明显下降;NLRP3炎症小体各蛋白组分都有明显下调,且siRNA干扰CD36后NOX1表达明显下降;siRNA干扰NOX1后,CD36表达无明显变化;加入caspase-1抑制剂预处理后,NLRP3炎症小体中,active caspase-1、cleaved IL-1β蛋白组分表达明显下调;(4)CD36 siRNA、NOX1 siRNA、NLRP3 siRNA、NAC、DPI、capase-1 抑制剂均可显著抑制IL-1β、IL-8生成;Anti IL-1βAb、IL-1 Ra均可抑制IL-8的生成;(5)在P.acnes刺激的角质形成细胞中,PPI能显著抑制IL-1β、IL-8的分泌,ROS 生成及 CD36、NOX1、NLRP3、ASC、Active Caspase-1、Cleaved IL-1β 蛋白表达;所有这些结果在24小时内均具有时间依赖性。结论:P.acnes通过与CD36识别,介导NOX1依赖的ROS产生,并最终诱导NLRP3炎症小体活化;由P.acnes活化NLRP3炎症小体生成的IL-1β可调控IL-8的分泌,而且至少部分是通过IL-1β/IL-1R信号调控的;PPI可抑制P.acnes活化的NLRP3炎症小体和炎症因子分泌。第二部分 PPI抑制P.acnes活化的TLR2-p38MAPK-NF-KB信号通路介导的炎症反应机制研究目的:本课题部分旨在讨论PPI抑制的P.acnes刺激的角质形成细胞TLR2-p38MAPK-NF-κB信号通路介导的炎症反应机制。方法:(1)检测TLR2介导的炎症相关因子表达:本部分拟选用不同菌液浓度的P.acnes刺激HaCaT角质形成细胞,建立体外炎症模型,用不同菌液浓度(105-107CFU/ml)P.acnes刺激HaCaT角质形成细胞,ELISA检测IL-6、IL-8、TNF-α分泌,流式细胞仪和western blot检测TLR2、TLR4的表达;后续实验中,我们选用了菌液浓度为107CFU/ml的P.acnes刺激HaCaT角质形成细胞,qPCR检测TLR2 mRNA、IL-1 α mRNA、K16 mRNA表达,western blot检测TLR2、IL-1α、K16蛋白和NF-κB、MAPK活化相关蛋白的表达。(2)研究PPI对TLR2-p38MAPK-NF-κB介导炎症反应的抑制作用:本部分拟筛选安全有效浓度的PPI分别作用于TLR2介导的炎症模型,通过CCK-8实验和前期预实验结果,确定PPI的安全浓度,我们将不同浓度梯度的PPI加入到P.acnes(107CFU/ml)诱导的炎症模型中,ELISA检测IL-6、IL-8、TNF-α的表达;qPCR 和 western blot 检测 TLR2、IL-1α、K16 表达;western blot 检测 NF-κB 和MAPK活化相关蛋白;免疫荧光检测胞内NF-κB活化情况。此外,ELISA检测PPI、NF-κB抑制剂和p38 MAPK抑制剂对P.acnes诱导IL-8分泌的影响。结果:(1)P.acnes能刺激HaCaT角质形成细胞TLR2、TLR4的表达和IL-6、IL-8、TNF-α分泌,且表达和分泌量与菌液浓度成正相关;(2)P.acnes可显著上调 TLR2 mRNA、IL-1αmRNA、K16 mRNA 表达和 TLR2、IL-1α、K16蛋白表达;NF-κB、MAPK活化相关蛋白表达均明显增加。(3)随着PPI浓度的增加,IL-6、IL-8、TNF-α及TLR2、IL-1α、K16表达显著下调,抑制NF-κB和MAPK活化相关蛋白的表达作用增强。(4)PPI、NF-κB抑制剂和p38 MAPK抑制剂可显著抑制IL-8的分泌。结论:PPI可能通过抑制P.acnes活化的TLR2-p38MAPK-NF-κB信号通路抑制与痤疮相关炎症因子的分泌而抑制炎症反应