副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)是定居在猪群上呼吸道的一种革兰氏阴性菌,但在特定的条件下如应激、免疫力低下和混合感染时,毒力菌株可以侵入宿主深部组织引起严重的革拉瑟氏病,主要表现为多发性的浆膜炎、关节炎和脑膜炎,是临床上危害养猪业的重要病原菌之一。对该病原的研究起步晚,且缺乏完善的遗传操作系统,导致目前HPS的毒力因子及其分子致病机制并不十分的清楚,给防制该病以及发展有效的新型疫苗带来了一定的困难。在本实验中,我们从临床上选择了两株HPS分离株(血清5型菌株SH0165和4型菌株7140),并通过动物感染实验证实其在致病力上的显著差异。通过两者基因组间的消减杂交,以及对消减文库的PCR筛选和斑点杂交验证,最终鉴定出了33个在强毒菌株SH0165中存在而在弱毒菌株7140中不存在的差异片段。这33个差异片段依据其对应序列的功能注释可以分为8大类,分别是sclB基因家族,限制修饰系统,噬菌体相关产物,转运系统,外膜蛋白类,代谢,DNA合成以及插入序列。随后,我们对除噬菌体相关片段以外的其他21个差异片段在不同毒力背景的15株HPS参考菌株和42株地方分离株中的流行情况进行了调查并做了统计分析,最终发现,sclB4, sclB7, sclBll, nhaC, ABC-type transport system和fhuA这6个基因在HPS高毒力菌株中的流行情况显著高于它们在HPS低毒力菌株中的流行,提示这些差异基因可能与HPS菌株的致病力存在潜在的关联。结合其他已有的HPS菌株毒力因子筛选的报道,我们选择了HPS菌株的capD基因进行后续基因功能的验证。capD基因编码一种多糖合成蛋白,该蛋白与创伤弧菌的1型荚膜多糖操纵子中的WbfY蛋白具有52%的氨基酸相似性,提示该基因可能与菌株荚膜的生物学功能相关。先前有研究报道,capD基因为HPS强弱毒菌株间的差异基因,在本实验中通过消减杂交并未筛出该基因,但结合其他报道我们在后续的PCR检测中发现该capD基因在强毒株SH0165中存在,而在弱毒株7140中不存在,推测capD基因可能为HPS菌株的一种潜在毒力相关基因,但该基因在致病中的作用并不清楚。本实验中,我们通过构建HPS强毒菌株SH0165的capD基因缺失突变株△capD以及互补菌株C-capD,直接证实了该基因与HPS菌株致病力之间的关系。结果表明,(1) capD基因的缺失导致HPS菌株对本动物猪的致病力显著降低,而将该基因互补之后其致病力明显得到提升；(2)野生株SH0165、缺失株AcapD以及互补菌株C-capD感染实验动物后,野生株SH0165和互补菌株C-capD可以有效地侵入机体各组织造成多系统感染,同时从这些组织中可以成功地分离到细菌,而缺失株AcapD无法造成多组织的感染,也不能分到菌,提示capD缺失后菌株向组织侵袭力的降低；(3) capD缺失后,HPS菌株对血清中补体介导的杀菌作用的抵抗力完全丧失,而该血清抗性在capD互补之后明显的恢复。综合以上结果表明,capD基因通过影响菌株的血清抗性继而参与菌株的致病过程,为HPS菌株的一种重要的致病因子。然而,本实验中通过透射电镜观察发现capD基因可能仅与荚膜中多糖的结构相关,而与菌株荚膜形成的有无并无直接关联,提示CapD蛋白参与菌株的血清抗性和致病可能与菌株的荚膜关联不大。我们随后通过蛋白质组双向电泳进一步寻找在capD缺失前后菌株蛋白水平上的差异,并鉴定出18个capD基因缺失后上调的蛋白和18个下调的蛋白。后续对这些差异蛋白功能的进一步分析将有助于我们更好地理解CapD蛋白与这些蛋白间可能的互作情况,以及它们与HPS菌株致病力的具体关系。另外,由细菌感染引发的脑膜炎一直是造成高死亡率的重要诱因之一,也是目前临床上急需得到控制的感染病症。HPS感染后的典型特征之一就是脑膜炎的发生,有文献报道,HPS毒力菌株可以有效地穿过脑微血管内皮细胞,继而突破血脑屏障(Blood-brain barrier, BBB)引起脑膜炎。但HPS侵入BBB这一过程的具体分子机制目前完全未知,一些与脑膜炎感染相关的分子靶标尚有待于逐步的发掘。目前国内对于细菌性脑膜炎的研究由于实验平台的不够完善以及脑组织细胞来源受限而未能较好的开展,本研究与国外脑膜炎致病机制研究团队合作,以引发中枢神经系统(CNS)感染最为常见的病原菌大肠杆菌(Escherichia coli) K1菌株作为代表菌株,探索在致脑膜炎菌株突破BBB致病过程中的重要分子靶标。在本研究中,我们首次直接证明了细胞中的一磷酸鞘氨醇(Sphingosine1-phosphate,S1P)和表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR)在致脑膜炎E. coli K1菌株RS218突破BBB过程中的重要功能。RS218菌株感染人脑微血管内皮细胞(HBMEC)可以激活SphK2/S1P/S1P2信号途径,继而引起由HB-EGF介导的EGFR的激活,具体体现在如下：(1)RS218菌株在侵入HBMEC时可以激活EGFR,且EGFR抑制齐剂gefitinib处理细胞以及通过EGFR显性突变体质粒转染细胞均可以导致菌株侵入水平的显著降低。此外,小鼠经gefitinib给药后可以显著地抑制RS218菌株对脑组织的感染；(2)RS218菌株侵入HBMEC可以激活鞘氨醇激酶SphK2,且利用SphK2抑制剂和S1P的受体拮抗剂阻断细胞S1P信号级联途径可以有效抑制RS218菌株对HBMEC的侵入。同时,小鼠SphK2基因敲除后,感染菌株随血液循环进入脑组织的数量也显著下降；(3)相同的E. coli菌体蛋白OmpA、 FimH和N1pI同时参与菌株在感染时对细胞EGFR的激活、S1P的产生以及SphK2的激活；(4)RS218侵入HBMEC过程中,SphK2/S1P/S1P2信号级联途径为EGFR激活的上游信号,且通过HB-EGF介导EGFR的激活；(5) SphK2/S1P/S1P2-EGFR信号途径通过激活c-Src以及后续的ERM蛋白,从而促进菌株突破BBB。以上结果表明,S1P和EGFR在脑膜炎菌株RS218突破BBB引发CNS感染过程中是两种十分关键的分子靶标,细菌通过激活这两种信号分子从而有助于自身的侵入。同时该结果提示,随着临床治疗过程中耐药菌株的大量出现,通过阻断这些致脑膜炎菌株在感染宿主细胞时利用的关键分子将为临床控制脑膜炎的发生和发展提供新的策略。