脑血管病是神经内科的常见病和多发病,与恶性肿瘤、心脏病一起构成人类的三大致死性疾病,其死亡率占全部疾病的10%,仅次于肿瘤。脑血管病是目前人类三大疾病死亡原因之一,存活者50%-70%遗留有瘫痪,失语等严重的后遗症,不仅给患者本人带来极大的痛苦,也给社会和家庭带来沉重的负担。溶栓治疗在急性缺血性脑血管病中是唯一被证明有效的,但只有一小部分病人从中获益。尽管有许多药物在动物实验中被证实有神经保护作用,但在临床中试验却以失败告终。临床试验失败的原因不是毒副作用太大,就是治疗时间窗太窄。因此广大学者一直在寻找一种治疗效果好,副作用少的神经保护药。脑缺血后几个小时立即出现炎症反应,同时小胶质细胞被激活。小胶质细胞在脑缺血炎性反应中的作用非常复杂,它可以通过释放神经营养因子起到修复作用,还可能直接吞噬坏死的组织。另外小胶质细胞的激活还可能释放一氧化氮,氧自由基等毒性物质损伤神经元。小胶质细胞的激活反应一直持续到缺血再灌注后几周。因此对炎性反应引起的第二次脑损伤进行干预有可能成为新的神经保护药物作用靶点。米诺环素是一种半合成的第二代四环素衍生物。对革兰氏阳性及革兰氏阴性球菌等都有较好的抗菌作用。米诺环素是1967年首次制得,具有四环素类药物基本的四环结构。它通过结合细菌核糖体的30R亚基,能阻止tRNA与受体位点结合,从而抑制蛋白质的合成,达到抗菌作用。米诺环素较其它四环素类药物具有较高亲脂性,容易透过血脑屏障到达中枢神经系统。因而在神经系统疾病治疗中发挥重要作用。最近在中枢神经系统动物模型研究表明米诺环素具有抗炎、抗凋亡、抗氧化等神经保护作用。本课题采用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,从以下几个方面进行研究,以探讨其对脑缺血再灌注损伤后脑神经保护作用及其可能的机制。1米诺环素对脑缺血再灌注后炎性反应影响。1.1研究目的通过免疫组织化学、放射免疫法、和RT-PCR方法,研究和探讨米诺环素对大鼠脑缺血再灌注损伤后炎性反应的影响。1.2研究方法利用线栓法制作脑缺血再灌注模型。研究了脑缺血前12h、缺血后30min、4h、12h给大鼠腹腔注射米诺环素(45mg/kg)及注射小剂量米诺环素(10mg/kg)对缺血再灌注损伤后炎性反应的影响及其可能机制。采用免疫组化的方法检测COX-2的表达；采用RT-PCR检测半暗带ICE的表达,采用放射免疫法检测缺血侧脑组织中PGE2的含量。1.3研究结果1.3.1 COX-2免疫组化阳性表达假手术组大鼠的大脑皮层只有少量COX-2染色阳性细胞,生理盐水组在缺血区周围可见大量COX-2染色阳性细胞,光密度值上升。与假手术组相比,差别有统计学意义(P=0.000)。米诺环素预处理组、30min、4h组及小剂量米诺环素组COX-2的表达减少,COX-2光密度值下降,与生理盐水组相比差别有统计学意义(P值分别=0.000、0.007、0.037、0.025)。12h组COX-2光密度值及阳性细胞数下降不明显,与生理盐水组相比,差别无统计学意义(P值=1.000)。1.3.2脑组织中PGE2的表达假手术组脑组织中PGE2呈低水平表达。脑缺血再灌注能诱导PGE2的表达,与假手术组相比,生理盐水组大鼠大脑皮层PGE2水平增高,差别有统计学意义(P=0.000)。而米诺环素能抑制脑缺血再灌注损伤后PGE2的表达。米诺环素预处理组、30min、4h组及小剂量米诺环素组缺血侧大脑皮层的PGE2水平下降,与生理盐水组相比差别有统计学意义(P值分别=0.003、0.032、0.047、0.048),12h组缺血侧大脑皮层PGE2亦有所下降,但与生理盐水组相比,差别无统计学意义(P=1.000)。1.3.3 ICE的表达假手术组大鼠的大脑皮层只有少量ICE表达,生理盐水组在缺血半暗带ICE表达增强,与假手术组相比,差别有统计学意义(P=0.012)。米诺环素预处理组、30min、4h组及小剂量米诺环素组ICE的表达降低,与生理盐水组相比,差别有统计学意义(P值分别为0.022、0.026、0.030、0.029)。而大鼠脑缺血后12h注射米诺环素对ICE的表达影响不大,与生理盐水组相比,差异无显著性意义(P=0.918)。1.4研究结论(1)脑缺血再灌注能诱导COX-2、ICE、PGE2的表达。(2)缺血前12h,缺血后30min、4h腹腔注射米诺环素及缺血后30分钟注射小剂量米诺环素(10mg/kg)能抑制大鼠脑缺血再灌注损伤后COX-2的表达。(3)缺血前12h,缺血后30min、4h腹腔注射米诺环素及缺血后30分钟注射小剂量米诺环素(10mg/kg)能抑制大鼠脑缺血再灌注损伤后ICE的表达。(4)缺血前12h,缺血后30min、4h腹腔注射米诺环素及缺血后30分钟注射小剂量米诺环素(10mg/kg)能降低大鼠缺血侧脑组织中PGE2的水平。2米诺环素对脑缺血再灌注后细胞凋亡的影响2.1研究目的通过免疫组织化学、Hoechst染色、核磁共振T2WI扫描,研究和探讨米诺环素对脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响。2.2研究方法在脑缺血再灌注模型上,采用免疫组织化学方法、Hoechst染色、核共振T2WI扫描,检测大鼠脑缺血前12h、缺血后30min、4h、12h腹腔注射米诺环素(45mg/kg)及脑缺后30min腹腔注射小剂量米诺环素(10mg/kg)对大鼠脑组织caspase-3表达、细胞凋亡及脑缺血体积的影响。统计分析采用SPSS13.0软件包,计量资料用均数士标准差(x±s)表示,不同组之间比较采用单因素方差分析,各组间两两比较方差齐使用Bonferroni法,方差不齐,使用Welch法和Dunnett’3法,P<0.05代表差别有统计学意义。2.3研究结果2.3.1 C aspase-3免疫组化阳性表达假手术组大脑皮层只有少量caspase-3(?)日性细胞,生理盐水组大鼠脑缺血灶边缘,可见大量caspase-3标记阳性细胞,光密度值上升,与假手术组相比,差别有统计学意义(P=0.000)。米诺环素预处理、30min组、4h组及小剂量米诺环素组,caspase-3光密度值下降,与生理盐水组相比差别有统计学意义(P值分别为0.000、0.000、0.003、0.020)。12h组大鼠脑缺血灶周围仍可见大量caspase-3阳性细胞,平均光密度值有所下降,与生理盐水组相比差别无显著性意义(P=1.000)。2.3.2 Hoechst染色Hoechst染色后正常神经细胞与凋亡的神经细胞均发出蓝色荧光,但正常细胞核呈弥散的,均匀分布,发出的荧光较微弱；而凋亡细胞的细胞核凝缩,碎裂,并发出强亮的荧光。假手术组仅有少量凋亡细胞,生理盐水组细胞凋亡增加,与假手术组相比,差异有显著性差异(P=0.000)。米诺环素预处理、30min组、4h组及小剂量米诺环素组凋亡细胞减少,与生理盐水组相比差别有统计学意义(P值分别为0.000、0.000、0.000、0.000),12h组脑缺血边缘仍可见大量凋亡细胞,与生理盐水组相比差别无统计学意义(P=0.645)。2.3.3 T2WI扫描假手术组T2WI扫描无异常信号,生理盐水组T2WI检测可见缺血侧大片高信号强度区。模型组T2WI检测都可见缺血侧高信号强度区。米诺环素预处理组,30min,4h组及小剂量米诺环素组缺血体积减少与生理盐水组相比,差别有统计学意义(P值分别为0.010、0.016、0.021、0.029),12h组脑缺血体积无明显缩小,与生理盐水组相比差别无统计学意义(P=0.998)。2.4研究结论(1)脑缺血再灌注后caspase-3光密度值增加,缺血半暗带神经元细胞凋亡数增多。(2)大鼠脑缺血前12h,脑缺血后30min、4h注射米诺环素(45mg/kg)及脑缺血后30min注射小剂量米诺环素(10mg/kg)能减少Caspase-3的表达。(3)大鼠脑缺血前12h,脑缺血后30min、4h注射米诺环素(45mg/kg)及脑缺血后30min注射小剂量米诺环素(10mg/kg)能抑制脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡。(4)大鼠脑缺血前12h,脑缺血后30min、4h注射米诺环素(45mg/kg)及脑缺血后30min注射小剂量米诺环素(10mg/kg)能缩小脑缺血体积。3米诺环素对脑缺血再灌注后脑水肿的影响3.1研究目的通过核磁共振DWI成像、T1WI增强扫描、T2WI扫描、HE染色,研究和探讨米诺环素对脑缺血再灌注损伤后细胞性脑水肿、血管源性脑水肿、血脑屏障及脑组织病理变化的影响。3.2研究方法雄性SD大鼠,随机分为假手术组、生理盐水组、米诺环素预处理组、30min组、4h组、12h组、小剂量米诺环素组(10mg/kg)。利用线栓法制作脑缺血再灌注模型。大鼠脑缺血再灌注后24h利用核磁共振DWI成像了解细胞性水肿情况,用T2WI扫描用于了解脑缺血再灌注损伤后血管源性脑水肿,用T1WI增强扫描了解血脑屏障破坏情况,HE染色了解脑组织病理变化情况。统计分析采用SPSS13.0软件包,计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,不同组之间比较采用单因素方差分析,各组间两两比较方差齐使用Bonferroni法,方差不齐,使用Welch法和Dunnett’3法,P<0.05代表差别有统计学意义。3.3研究结果3.3.1磁共振弥散加权成像假手术组磁共振DWI扫描无异常信号,生理盐水组DWI扫描可见大片异常信号区,rADC值下降,与假手术组相比,差别有统计学意义(P=0.000)。模型组DWI扫描均可见高信号区,米诺环素预处理组、30min组及小剂量米诺环素组rADC有所上升,与生理盐水组相比差别有统计学意义(P值分别为0.000、0.000、0.036)。4h组及12h组rADC值亦有相应上升,与生理盐水组相比,差别无统计学意义(P值分别为1.000、1.000)。3.3.2核磁共振T1WI增强扫描假手术组T1WI增强扫描无异常表现,各模型组增强扫描后均出现不同程度的强化,从病灶中心到周围正常组织之间信号强度逐渐减低。生理盐水组增强扫描可见强化,相对信号强度增高,与假手术组相比,差别有统计学意义(P=0.000)。米诺环素预处理组,30min组、4h及小剂量米诺环素组增强扫描后其相对信号强度与生理盐水组相比下降,差别有统计学意义(P值分别为0.003、0.019、0.043、0.027),而术后12h组增强扫描后信号强度下降不明显,与生理盐水组相比差别无统计学意义(P=1.000)。3.3.3核磁共振T2WI扫描假手术组T2WI扫描无信号异常,各模型组患侧T2WI扫描均出现高信号。生理盐水组相对信号强度增高,与假手术组相比差别有统计学意义(P=0.000)。米诺环素预处理组,30min组、4h及小剂量米诺环素组能降低T2WI相对信号强度,与生理盐水组相比,差别有统计学意义(P值分别为0.003、0.004、0.032、0.048)。12h组相对信号强度下降不明显,与生理盐水组相比,差别无统计学意义(P=0.499)。3.3.4 HE染色假手手术组大鼠大脑皮层组织形态结构没有明显的变化,细胞膜完整,染色质均一。生理盐水组可见大脑皮质神经元灶性或片状坏死,胶质细胞增生、结缔组织及神经元水肿明显,周围间质高度水肿。米诺环素预处理组,30min组,4h,小剂量米诺环素组,神经元坏死减少,胶质细胞及神经元及间质水肿明显改善,损伤程度减轻。术后12h组在病灶侧仍可见大片神经元坏死,神经元,胶质细胞及周围间质明显水肿。3.4研究结论(1)脑缺血再灌注损伤后出现细胞性脑水肿,血管源性脑水肿,血脑屏障明显破坏。(2)脑缺血前12h,缺血后30min注射米诺环素(45mg/kg)及脑缺血后30min注射小剂量米诺环素(10mg/kg)能减轻大鼠脑缺血再灌注损伤后细胞性水肿；(3)脑缺血前12h,缺血后30min、4h腹腔注射米诺环素(45mg/kg)及脑缺血后30min注射小剂量米诺环素(10mg/kg)能缓解脑缺血再灌注损伤后血管源性脑水肿；(4)脑缺血前12h,缺血后30min、4h腹腔注射米诺环素(45mg/kg)及脑缺血后30min注射小剂量米诺环素(10mg/kg)能减轻脑缺血再灌注损伤后血脑屏障的破坏；(5)脑缺血前12h,缺血后30min、4h腹腔注射米诺环素(45mg/kg)及脑缺血后30min注射小剂量米诺环素(10mg/kg)能减轻脑缺血再灌注后脑组织病理损伤。4全文结论(1)脑缺血再灌注能诱导COX-2、ICE、PGE2的表达。(2)大鼠在脑缺血前12h,缺血后30min,4h注射米诺环素能减少COX-2的表达,小剂量米诺环素亦能抑制脑缺血后COX-2的表达。(3)大鼠在脑缺血前12h,缺血后30min,4h;注射米诺环素能抑制缺血半暗带ICE的表达。小剂量米诺环素能抑制ICE的表达。(4)大鼠在脑缺血前12h,缺血后30min,4h注射米诺环素能降低脑大鼠组织中PGE2的水平。小剂量米诺环素能达到降低缺血侧PGE2的作用。(5)脑缺血灌注后caspase-3表达增强,缺血半暗带神经元细胞凋亡数增多。(6)在脑缺血前12h,缺血后30min,4h给大鼠注射米诺环素能抑制caspase-3的表达,小剂量米诺环素对脑缺血后caspase-3的表达亦有抑制作用。(7)大鼠在脑缺血前12h,缺血后30min,4h注射米诺环素能抑制脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡。小剂量米诺环素亦能减少脑缺血后细胞凋亡。(8)大鼠在脑缺血前12h,缺血后30min,4h;注射米诺环素能缩小脑缺血体积。小剂量米诺环素亦能缩小脑缺血体积。(9)脑缺血再灌注损伤后有细胞性脑水肿,血管源性脑水肿,血脑屏障明显破坏。(10)脑缺血前12h,缺血后30min给大鼠腹腔注射米诺环素能减轻脑缺血后细胞性水肿,小剂量米诺环素亦能抑制缺血后细胞性水肿。(11)脑缺血前12h,缺血后30min、4h给大鼠腹腔注射米诺环素能缓解脑缺血再灌注损伤后血管源性脑水肿,小剂量米诺环素亦能减轻脑缺血后血管源性脑水肿。(12)脑缺血前12h,缺血后30min,4h注射米诺环素能明显减轻大鼠脑缺血再灌注损伤后血脑屏障的破坏,小剂量米诺环素亦能减轻缺血后血脑屏障的破坏。(13)脑缺血前12h,缺血后30min、4h腹腔注射米诺环素及小剂量米诺环素能明显减轻大鼠脑缺血再灌注后脑组织病理损伤。