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目的:通过检测血清中活化因子IL-2、PDGF蛋白的表达,观察益肾方在大鼠骨折愈合过程中对于JAK2/STAT3信号转导通路带来的影响。并使用免疫组化法检测骨痂JAK2、STAT3蛋白的表达,研究益肾方影响骨折愈合的机制,从多角度探讨其对骨折治疗的作用,为发现新的骨折治疗方法打下理论基础。材料与方法:实验动物为SD级雄性大鼠,共48只,由辽宁长生生物技术有限公司提供。购入后在辽宁中医药大学实动物房内进行适应性喂养,一周之后进行称重。将大鼠随机分成四个组别,分别为正常组、模型组、益肾方治疗组、伤科接骨片阳性药物组。造模方法:选用开放骨折模型,对模型组、益肾方治疗组、伤科接骨片阳性药物组进行造模,造模前8h对大鼠禁食,无需禁水。使用浓度为10%水合氯醛(3ml/kg)通过腹腔注射对大鼠进行麻醉,生效后,将大鼠俯卧位置于操作台上,显露大鼠左侧下肢及臀部的皮肤,常规消毒。在大鼠左股骨外侧做长度约为2.5cm的直切口,将皮肤切开后,钝性分离大鼠肌肉筋膜组织,显露股骨干,切记广泛剥离;在大鼠股骨干中段用电钻一小孔,然后用止血钳和镊子以钻取的小孔为受力点将股骨干折断(注意骨折断端的完整);使用0.1(直径为0.1毫米)的克氏针由骨折断端逆行插入股骨干近端髓腔,自股骨大转子处穿出;然后进行复位,并在复位后将针尾反向穿入远端髓腔内;固定确实后活动术肢,观察折端是否固定良好,如无活动,将针尾在股骨大转子根部处折弯,并将克氏针过长部分剪除;以生理盐水冲洗术区,然后用无菌纱布蘸干并依次缝合肌肉、筋膜和皮肤。造模成功后分笼饲养,观察一周,期间按需供应饮食和水。一周后进行正式药物实验。益肾方治疗组给予益肾方中药汤剂,每副中药充分煎煮两次后配成生药浓度为1g/ml的中药液,阳性药物由辽宁中医药大学附属医院药剂室提供,生产商为大连美罗中药厂有限公司,规格0.36g,国药准字Z21021461,采用生理盐水配置,溶液规格为1ml/100g,1ml含0.39mg药粉。正常组和模型组给予等量生理盐水灌胃,1次/日(8:00-10:00AM)。连续灌胃21天之后将大鼠处死,取动脉血,离心后保留血清,取大鼠患肢股骨,清理后固定。使用ImagePro plus6.0图像分析软件测定骨组织标本中阳性表达蛋白的平均光密度值(MOD)。酶联免疫吸附分析法检测血清中IL-2、PDGF;免疫组织化学检测骨痂中JAK2、STAT3蛋白表达,四组比较。使用统计软件SPSS19.0做统计学处理,P<0.05表示有统计学意义。结果:1、大鼠开放骨折模型造模成功,因术后感染和反复灌胃操作过程中,死亡5只大鼠,死亡时间集中在造模后一周,其中模型组死亡2只,益肾方治疗组死亡1只,伤科接骨片阳性药物组死亡2只。死因可能为:(1)手术对动物创伤较大;(2)手术切口感染。2、平均光密度值测定:模型组JAK2、STAT3阳性蛋白的平均光密度值(MOD)显著高于正常组(P<0.05,P<0.01),益肾方治疗组、伤科接骨片阳性药物对照组JAK2、STAT3的阳性细胞数的平均光密度值(MOD)明显低于模型组(P<0.05,P<0.01)有统计学意义。3、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清:与正常组比较,模型组大鼠血清中IL-2含量升高(P<0.01),血清PDGF含量显著升高(P<0.05);与模型组比较,益肾方治疗组、伤科接骨片阳性药物组血清IL-2水平显著降低(P<0.05,P<0.01)有统计学意义,血清PDGF水平显著降低(P<0.05,P<0.01)有统计学意义。4、免疫组化形态学检测:正常组、模型组、益肾方治疗组、伤科接骨片阳性药物组骨痂标本免疫组织化学结果提示:模型组、益肾方治疗组、伤科接骨片阳性药物组的JAK2、STAT3蛋白表达为阳性,正常组JAK2、STAT3蛋白表达为阴性。结论:该实验造模成功,采用开放骨折模型,大鼠股骨中段开放骨折克氏针内固定骨折模型,稳定、简便易行、可复制性强、造模成功率高。实验研究结果提示了益肾方作用机制可能是通过下调JAK/STAT通路上的活化因子白细胞介素-2(IL-2)及血小板衍生生长因子(PDGF)的表达,进而抑制JAK2/STAT3信号通路的活化。本次实验初步探究了益肾方通过减少炎性细胞因子漏出,阻断骨折大鼠JAK2/STAT3信号转导通路,改善骨折损伤局部的微环境。益肾方对大鼠骨折愈合具有促进作用,缩短了大鼠急性骨损伤的愈合周期,加快骨折愈合进程。