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捕捞后的海参在贮运以及加工过程中极易自溶,内源性蛋白酶是海参自溶的根本原因。研究发现,内源性半胱氨酸蛋白酶(endogenous cystaine protease,ECP)是参与海参自溶的主要内源蛋白酶类型之一。而负责调控海参ECP的内源性抑制剂的活性变化情况始终未见报道。因此,本文对海参ECP抑制剂(ECPI)的理化特性及自溶过程中的活性变化进行了研究。实验室前期获得一个海参ECPI基因—cystatin,本论文利用重组cystatin蛋白制备特异性抗体,采用免疫组织化学方法考察了自溶过程中cystatin在海参体壁中分布的变化。优化了适于检测海参ECPI活性的反向酶谱法,考察了木瓜蛋白酶添加量、孵育pH和温度对ECPI在反相酶谱上呈现活性的影响,发现木瓜酶加量为400μg/L、pH7.0、孵育温度为40℃时,活性最强。以上述优化条件检测了海参在4℃、10℃、20℃、30℃自溶过程中ECPI活性的变化,同时采用明胶酶谱法结合E-64考察了ECP活性变化情况,采用SDS-PAGE考察了自溶程度。研究发现,在上述不同温度下,海参自溶过程中体壁蛋白均发生显著降解,ECP的活性均随自溶时间的延长呈增强趋势,而ECPI的活性则相对稳定。利用本实验室前期克隆的一个ECPI基因cystatin,进行重组cystatin的表达和分离纯化,利用反相酶谱考察了其最适pH和温度,结果与上述内源性ECP抑制剂的结果一致。制备了重组cystatin的特异性抗体,利用免疫组化方法对海参体壁中cystatin的分布及自溶过程中的变化进行了原位检测。20℃自溶48h的结果显示,海参体壁中cystatin的表达量基本不变,与上述反相酶谱的检测结果(ECP抑制剂在自溶过程中的活性相对稳定)一致。这种ECP活力上升而ECPI活力不变的模式提示自溶过程中ECPI对ECP的调控功能或与ECP的分子间相互作用关系发生了改变。另外,海参自溶48h后,内皮层中cystatin阳性细胞的数量增多,提示高表达cystatin的海参细胞在自溶过程中发生了一定迁移,迁移机制很可能与海参缺氧、自溶应激有关。因此,海参ECP及其抑制剂在自溶过程中的相互作用值得深入研究。