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前言 人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)是获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)的病原体，HIV感染／AIDS目前尚无法治愈，也无有效的疫苗预防。到2002年底全球已有6000万HIV感染者，给人类造成的危害日益严重。在HIV的复制过程中，HIV不仅编码了结构蛋白和酶蛋白，而且编码了一些辅助调节蛋白，其中包括一段由86-130个氨基酸组成的能够调节HIV转录的反式激活蛋白Tat(Trans-activator protein)。Tat蛋白作用于转录启动反应因子(transactivation response element，TAR)，除了Tat以外，其它的细胞因子也可以结合此因子促进转录，但作用机制尚不清楚。比较认可的理论是Tat通过转录反应因子与某些细胞因子作用形成蛋白-RNA复合物，活化转录启动因子，从而加强HIV RNA多聚酶Ⅱ的活性，促进病毒的转录。有研究表明HIV-1感染者体内的病毒复制水平决定疾病的进程。疾病快速进展期的病人体内的HIV-1复制水平很高，致使CD4的T淋巴细胞数量迅速下降，最终导致发展成AIDS病。一些无症状的感染者体内的病毒载量通常不高，病毒复制效率也低。既然疾病进展的先决条件是有效的高水平的HIV-1复制，而病毒反式激活因子Tat和长末端重复序列上LTR的反式激活反应区TAR的相互作用又能够提高病毒复制水平，那么是否tat基因的变异会影响到Tat蛋白的功能，改变病毒的复制和病毒的表型，进而影响感染者体内的病毒载量，感染者的CD4+的T淋巴细胞数量等，从而影响疾病的进展，国内尚未见相关报道。本研究拟通过我院艾滋病确认实验室几年来收集的22例HIV感染者及AIDs患者外周血单个核细胞(PBMC)，对基因组中整合的班V一1前病毒DNA反式激活蛋白几t第一外显子的基因序列扩增、测定和分析，明确我国HIV一1感染者中病毒基因组中tat区第一外显子基因序列的特征;病毒核昔酸和氨墓酸突变的种类及变化;探讨HIV一ltat区第一外显子基因突变与病情进展程度的相关性。材料和方法 收巢我国HIV感染者的流行病学资料，临床资料及全血标本一70℃保存。扭V一ltat基因第一外显子基因序列测定:伍明画Ck孙in kit从全血标本中提取基因组DNA(含有整合的HW一1前病毒DNA)，提取的DNA以tat调节基因区特异性引物N种/ENV一1为外侧引物进行第一轮PCR扩增，以tat一B/NPn为内侧引物进行nested一PCR扩增。1%潮旨糖凝胶电泳检测目的扩增片断，与分子tM毗er对比无误后切取该片断。QIA州ck Gel凡由action儿t回收目的DNA片断。u一CoR Glob以IRZ system测序仪进行基因序列测定。不同疾病进展阶段的HIV一l感染者体内扭V一1核昔酸及氨基酸序列特征分析:按不同疾病进展阶段对我国HW一1感染者进行分组。厂使用BIOEDrr软件包中CU巧叨比W程序进行序列排列比对、生成共享序列，并在核昔酸序列中人工引人名牌钾以保持翻译完整性。以PHYLI[P软件包中DNADIST(儿~，。two pa目旧团Leters毗山闭)计算毒株间核昔酸及氨基酸离散率，并在此基础上以NEIGHBOR程序生成系统进化树(neig址沁r一joining碱，rithm)。统计tat调节基因区第一外显子核昔酸及氮基酸突变位置和种类，并检索班V弘秘nee Data]比Se，与国内外FaV流行株序列进行比较，结合CD4计数资料分析HIV，一1基因突变与疾病进展程度之间的关系。结果 1 .AIDS患者与无症状感染者Tat蛋白序列的比较 由env和gag区分型确定的巧例B‘亚型，与B’亚型共享序列比较，发现:7位出现N取代R;20位出现P取代T;24位出现K取代N;58位出现T取代A;59位出现H取代P;64位出现N取代T。这些变异AIDS病组要高于无症状感染组。 B‘/C重组亚型中，与BC重组共享序列比较，在AIDS病组发现:58位出现T取代A;62位出现R取代S，无症状感染组未发现此变异。 2 .AIDS患者与无症状感染者HIV一1的tat基因离散率 辽宁省流行的扭V一l毒株与相应的国际共享序列tat区基因离散率差别很大。AIDS患者感染的HIV一IB‘亚型基因离散率比无症状感染者的大。 3 .AIDS患者与无症状感染者HIV一ltat基因的系统树分析 在系统进化树上各HW一1亚型毒株分别与其相对应的国际共享序列聚集在一起，同亚型内AIDS病患者与无症状感染者呈混合分布。讨论 HIV一1的基因组呈现出高度的变异性，这些基因水平的差异当被翻译成有功能的蛋白质后，表现出了生物学性质的差异。Tat蛋白能够调节病毒的转录，从而影响病毒的复制，Tat区发生变异，能够影响病毒的复制。.国外学者利用定点突变的方法体外实验证实，Tat区第一外显子22位G取代C，28位R、Q取代K，41位A取代K，50位R、Q取代K等基因突变会极大的降低病毒的复制能力，而58位T取代A，65位D取代H会提高病毒的复制能力。国外还有学者发现，长期不进展者体内的病毒并未出现22，28，41，50位的基因突变，而AIDS患者体内的病毒却发生了58位和65位的基因突变，说明可能与疾病进展有关。与国外报道一致，我国的AroS患者存在tat基因第一外显子58位T取代A的基因突变，但未发现有65位D取代H?