感染人的疟原虫主要有四种，包括恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫，其中恶性疟原虫是引起疟疾死亡的主要病原体。　　遏制青蒿素抗性的关键是要防止抗性虫株的扩散和蔓延，而阻止其扩散的有效途径是采用有效检测和监测手段及时发现抗性虫株。疟原虫抗药性检测方法包括标准体内28天法和体外微量法。但48小时标准体外微量法不适合青蒿素抗性的检测，该法的结果不能反映恶性疟原虫对青蒿素的体内敏感性。最近报道的一种称为“环状体生存试验”的体外方法（RSA0-3h），其检测结果能反映恶性疟原虫对青蒿素的体内敏感性，可用于恶性疟原虫对青蒿素敏感性的体外测定。除了体内法和体外法外，以抗性基因为基础的分子检测也是疟原虫抗药性检测和监测的重要手段。近两年在青蒿素抗性标识分子的发现和应用方面取得了重大突破。Ariey等发现了恶性疟原虫kelch13基因的突变与青蒿素抗性相关，特别是该分子第493、539、543、580位氨基酸突变与恶性疟原虫青蒿素抗性尤其相关。然而近期一些研究显示并非所有抗性虫株均存在该基因的突变，而该基因在这些位点的突变也并非均显示有青蒿素抗性。　　尽管已经发现了kelch13基因与青蒿素抗性相关，但仅此分子仍然不能解释青蒿素抗性的全部机制，需要从全基因组范围内从不同角度进一步鉴定青蒿素抗性相关的分子及机制。对此，本课题首次从我国云南省及中缅边境地区采集了恶性疟原虫地理虫株，建立了恶性疟原虫体外连续培养体系，通过体外药物压力下培育抗性虫株的方法，成功培育了9株恶性疟原虫青蒿素抗性虫株，并采用高通量测序的方法进行表达谱分析，以发现抗性相关的基因，具体结果如下：　　（1）建立了恶性疟原虫野生虫株的体外连续培养：从中缅边境地区采集了9株恶性疟原虫地理株，经现场显微镜镜检确认为恶性疟感染后，冻存于液氮罐中，空运至实验室。采用恶性疟原虫常规培养的方法，成功建立了9株恶性疟原虫的连续培养。　　（2）体外药物压力下青蒿素抗性虫株的培育：采用不断提高药物浓度的方法在体外培育青蒿素抗性虫株。恶性疟原虫置于六孔板中进行正常培养，当原虫密度达到5%时，在培养物中加入一定浓度的青蒿素，24小时后检测原虫感染率。当原虫率小于5%，则改换不含药物培养液培养；如果原虫率大于5%，则继续用含青蒿素的培养液培养24小时。如果经过加药培育48小时后，原虫感染率仍大于5%，则提高药物浓度；培育初始青蒿素浓度为50nM，然后逐渐增加药物浓度，直到培育出能在较高浓度青蒿素中生长的抗性虫株。9株恶性疟原虫虫株（虫株名称分别为F0727、F0827、F09M13、F09P18、F0758、F0870、F0871、F09P1和F0867）分别经历了38、38、36、36、34、33、29、29、29个月和178、222、163、132、142、117、117、117和86次加药培育；最终这9株虫株分别能在4.0、6.0、3.0、1.0、2.0、1.5、4.0、2.0、4.0μM青蒿素浓度中生长，其中虫株F0827ART的最高适应生长青蒿素浓度为6.0μM，比最初适应浓度提高了120倍。　　（3）培育的抗性虫株对青蒿素等药物敏感性的测定：采用“环状体生存试验”的体外方法（RSA0-3h）检测上述培育的9株抗性虫株（分别定名为F0727ART、F0827ART、F09M13ART、F09P18ART、F0758ART、F0870ART、F0871ART、F09P1ART和F0867ART），并与培育前虫株进行对照，结果显示：9株培育前虫株的RSA0-3h值分别为0.0%、16.6%、0.1%、0.1%、0.8%、0.1%、0.3%、0.4%和0.2%，而培育后虫株的RSA0-3h值分别为12.0%、11.3%、0.4%、1.0%、3.5%、8.8%、8.3%、27.6%和29.3%。比较每个虫株培育前后RSA0-3h值显示，除F0827外，其它虫株经青蒿素培育后，其RSA0-3h值均有提高，差异倍数均大于4倍，经配对比较的符号秩和检验显示均有显著差异（P＜0.05），表明均有不同程度抗性产生。F0827ART虫株在培育前已显示16.6%的RSA0-3h值，表明该虫株野生株已产生了青蒿素抗性，但在经三年的青蒿素培育过程，其青蒿素抗性程度并未见有进一步提高，反而有所下降。　　（4）培育的抗性虫株对其它抗疟药敏感性的测定：我国云南地区抗疟药使用历史较为复杂，为了解这些虫株对常用抗疟药的敏感性以及培育前后对其敏感性的变化，我们检测了9株培育前后恶性疟原虫虫株对氯喹和乙胺嘧啶/磺胺多辛的药物敏感性。　　结果显示：9株采自中缅边境地区的恶性疟原虫在经过24到38个月的连续正常培育后，对氯喹和乙胺嘧啶/磺胺多辛仍然有抗性；而经过在含青蒿素的培养液中连续培育24到38个月后，9株虫株对乙胺嘧啶/磺胺多辛的药物敏感性均有所提高，经配对比较的符号秩和检验显示均有显著性差异（P＜0.05）。另外，经过抗性培育后的虫株中有3株对氯喹显示为敏感（IC50值小于100ng/l）。这表明目前临床上观察到的恶性疟原虫对氯喹和乙胺嘧啶/磺胺多辛等药物敏感性逆转的原因可能是青蒿素类药物大量使用引起的。　　（5）培育虫株kelch13基因多态性分析：自然界产生的青蒿素抗性虫株多数与kelch13基因突变有关。对此本研究采用PCR扩增和测序的方法，对9株培育前后虫株进行kelch13基因突变分析。　　结果显示：除F0827以外，其余8个虫株，虽然经过长期青蒿素抗性培育且RSA0-3h值显著提高，但其kelch13基因型没有发生变化，包括F09M13、F09P18、F0870、F0867虫株均为野生型；F0727株培育前后均为P441L突变；F0758、F0871株培育前后均为F446I突变；F09P1株培育前后均为E556D突变。特别是F0827虫株，培育前野生株存在R539T高抗性相关的突变，但培育后虫株显示为野生型，其RSA0-3h值有所下降但仍然为高抗性（11.3%）。进一步分析显示，培育前虫株在kelch13基因R539T上存在一个套峰，分别是G/C，代表突变型（C）和野生型（G），这表明该虫株为混合感染株，而培育后虫株在该位点只剩为野生型基因型，突变型原虫在培育过程中消失了。这表明青蒿素抗性存在不同的分子机制，对于体外培育的抗性虫株以及部分自然产生的抗性虫株可能存在kelch13以外的青蒿素抗性相关的基因。　　（6）培育前后虫株转录谱分析：基于上述研究显示，疟原虫青蒿素抗性涉及除kelch13以外的抗性分子。为进一步鉴定此类分子，本研究选择2株培育前后的虫株（F0727ART VSF0727、F0867ART VS F0867）进行转录谱测序及分析。　　结果显示，49个基因表达差异倍数大于2倍，且FDR＜0.001。在此基础上，我们采用Realtime PCR的方法，对7株培育前后虫株进行49个基因表达差异的验证。　　结果显示，7株培育后虫株一致表达下调的基因是酰基辅酶A合成酶基因（PF14_0761）；与培育前相比，表达差异倍数均大于6倍，经配对比较的符号秩和检验P值＜0.01，呈显著性差异。　　此外，为了了解我国云南及边境地区恶性疟原虫是否已产生青蒿素抗性，本研究采用RSA0-3h的方法，对云南省及中缅边境地区采集的27株恶性疟原虫虫株进行检测，以FCC1/HN标准株为阴性对照；另外，为了解恶性疟原虫青蒿素抗性与kelch13基因突变的关联性，本研究通过PCR扩增后进行测序的方法对这些恶性疟原虫地理株的kelch13基因进行了检测分析并取得了以下结果：（1）按上述方法建立了恶性疟原虫野生虫株的体外连续培养；（2）中缅边境地区恶性疟原虫地理株的RSA0-3h的中位数为0.40%（IQR，0.11%-1.33%）；（3）以本实验室检测的云南边境地区59株野生型地理株（即在kelch13基因未突变的虫株）的P95值1.005%为阈值，结果显示有8个虫株的RSA0-3h的值大于阈值，其中有3个虫株的RSA0-3h值大于10%（分别为F0827：16.60%；F0835：18.96%；F09A16：15.63%）；（4）本研究采用PCR扩增和测序的方法对27株采自中缅边境地区的虫株进行kelch13基因的突变分析，结果显示：27株地理株中有11株发生了kelch13基因突变，突变率为40.7%；其中P441L、F446I、E556D突变与青蒿素抗性无关，R539T、H719N突变与青蒿素抗性相关。并非所有抗性虫株均存在kelch13基因突变；其中F09A16虫株显示为对青蒿素高抗性（15.63%），但kelch13基因并未发现有突变。　　本研究采用体外连续加药培育的方法培育出9株恶性疟原虫青蒿素抗性株，通过RSA0-3h检测显示这些培育虫株具有不同程度青蒿素抗性，但其kelch13抗性基因在培育前后并未发生变化，自然界产生青蒿素抗性虫株也存在类似现象，即抗性虫株的kelch13基因并未发生突变或突变虫株并未产生抗性，这些均提示青蒿素抗性产生过程可能涉及除kelch13以外的基因。本文通过对培育前后虫株表达谱的分析，发现了酰基辅酶A合成酶基因（PF14_0761）表达下调与恶性疟原虫青蒿素抗性存在相关性，这为恶性疟原虫青蒿素抗性机制研究提供了新的线索。进一步研究需要扩大样本，包括一些自然产生的青蒿素抗性虫株，以明确该分子与恶性疟原虫产生青蒿素抗性的关联性，为青蒿素抗性虫株的检测和监测提供新的标识分子。