帕金森病(Parkinsons disease,PD)是中枢神经系统退行性疾病,具有明确的临床症状,包括静止性震颤、肌肉强直、运动迟缓、姿势平衡障碍,还常伴有认知功能障碍、抑郁等非运动症状。PD主要病理特征为黑质多巴胺能神经元病变,纹状体DA含量显著降低。目前,PD发病原因及机制尚不清楚,临床治疗仅能够控制症状,并不能延缓或阻止病情的发展。　　 百可利是本实验室利用高通量药物筛选技术发现的具有抗6-OHDA神经毒性及促进PC12细胞分化作用的化合物。经过晶型转化,提高了口服生物利用度。体内药效学研究表明,百可利对PD小鼠、大鼠、食蟹猴模型具有明显的治疗作用,对震颤的治疗效果尤为明显,作用机制尚不明确。　　 本研究首次根据临床症状将PD大鼠模型分类,探讨震颤与运动障碍的相关性,在此基础上,研究PD病理机制及百可利的治疗作用,结合细胞和分子水平相关实验,分析百可利治疗PD的作用机制。　　 一、百可利对6-OHDA致帕金森病大鼠模型的作用及机制研究　　 本研究采用纹状体单侧两点注射6-OHDA,制备PD大鼠模型。术后5周,筛选模型,根据震颤和运动障碍程度筛选模型动物,进行分组,分为震颤型、运动障碍型、混合型。给药组灌胃给予200 mg/kg百可利,阳性对照组灌胃给予50 mg/kg美多芭。给药3周、6周,通过行为学检测,包括肌电测试、转棒、自主活动、APO诱导旋转、morris水迷宫实验,考察药物对震颤、运动功能、学习记忆能力的影响。通过检测黑质TH表达、纹状体DA、ACh含量,考查药物对多巴胺能、胆碱能系统的影响。通过检测纹状体NMDA、GFAP的表达,及氨基酸类递质含量变化,考察药物对非DA系统的影响。在RNA水平,应用基因芯片技术,筛选纹状体差异表达基因。　　 给予百可利(1)显著降低震颤型、混合型模型大鼠震颤频率；对不同类型的模型大鼠的运动障碍缓解程度不同；改善混合型、运动障碍型模型大鼠空间学习记忆能力；显著抑制混合型模型大鼠APO诱导的旋转；(2)增加模型大鼠黑质TH表达,纹状体DA含量呈增加趋势,ACh含量呈降低趋势,海马ACh含量无变化；(3)降低震颤型、混合型模型大鼠纹状体GFAP、NMDA的表达,显著降低震颤型模型大鼠纹状体Glu、Gln含量。基因芯片检测结果提示,百可利组的差异表达基因与线粒体功能、泛素蛋白酶系统、谷胱甘肽代谢系统、钙的调节、神经递质系统、离子通道相关。综合分析,综合分析,百可利抑制黑质病变区神经元缺失,具有神经保护作用。可能通过纠正DA与ACh不平衡状态,缓解运动功能障碍,表现在转棒持续时间延长,APO诱导旋转降低。可能通过调节钙离子、离子通道,影响中枢异常电活动,治疗震颤。　　 给予阳性药美多芭,纹状体单胺类、氨基酸类神经递质呈不同程度的增加,但DA能神经元缺失无明显改善,在疾病早期可以控制症状,但是在疾病晚期增加APO诱导的旋转,提示出现疗效减退,运动症状波动等副作用。　　 二、百可利对PC12细胞多巴胺系统的影响　　 体内实验结果表明百可利能够提高纹状体DA含量,纠正EDA与ACh的不平衡状态。为了探讨其作用机制,我们以多巴胺能细胞-PC12为研究对象,在不同条件下给予百可利,经HPLC-ECD法检测DA及其代谢产物的含量,经Western免疫印迹法检测DA合成、代谢、转运酶的表达。结果显示:(1)百可利对钙依赖性,对短时自发性DA释放无影响；(2)百可利能够显著提高rotenone损伤及正常PC12细胞的DA含量；(3)百可利提高PC12细胞外DA含量呈时效、量效关系；(4)百可利显著降低细胞外和细胞内HAV含量,增加细胞内DOPAC、NE含量；(5)百可利能够剂量依赖性降低COMT,DAT的表达,对TH、MAOB、DBH的表达无影响。以上结果可以说明两点:其一、百可利增加DA含量的作用明确；其二、百可利通过下调COMT和DAT的表达,抑制DA的代谢和再摄取功能,从而提高DA含量。　　 三、百可利对细胞兴奋性的影响　　 中枢神经系统过度兴奋、异常的神经冲动传导可能是帕金森病震颤的病理基础。本部分研究以PC12细胞为研究对象,以钙离子载体ionomycin为工具药,引起钙离子内流、细胞兴奋,在此基础上给予百可利,观察作用特点。应用荧光染料DiBAC4(3)指示细胞膜电位,百可利能够剂量依赖性抑制ionomycin引起的细胞去极化。以荧光探针Fluo-3/AM负载细胞,应用激光共聚焦扫描显微镜观察细胞内钙离子变化,结果表明百可利能够显著抑制ionmycin引起的细胞内钙离子增加。应用HPLC-ECD检测神经递质的释放量,结果显示百可利可以选择性拮抗钙依赖性的谷氨酸释放,对DA释放无影响。以上结果提示,百可利可能具有调节中枢异常电活动的作用,此推测还需要在体内、体外实验中进行验证。　　 四、百可利对帕金森病相关细胞模型的保护作用及机制探讨　　 为了确证百可利的神经保护作用,研究其作用机制,在细胞水平考察了百可利对多种神经毒素引起的神经损伤的作用。结果显示百可利显著提高6-OHDA、MPTP致SH-SY5Y、PC12细胞损伤模型的细胞存活率。　　 在进一步研究中,以线粒体复合物Ⅰ抑制剂rotenone损伤PC12细胞,建立体外帕金森病模型。结果发现2μM rotenone显著降低ATP含量、增加ROS含量、诱导线粒体膜电位缺失、增加caspase-3及caspase-9活性、降低细胞存活率、诱导细胞凋亡。给予百可利(10～40μM),能够不同程度的改善上述指标,提示百可利能够抑制线粒体介导的凋亡通路。　　 为了进一步揭示百可利的作用机制,以大鼠脑线粒体为研究对象,进行rotenone体外孵育损伤,观察百可利对线粒体的直接作用。结果表明,百可利显著抑制rotenone引起的ROS增加、ATP含量下降、及线粒体肿胀。通过检测线粒体呼吸速率,发现单独给予百可利能够显著降低V4、提高RCR,提示百可利抑制电子漏流、减少ROS的生成、提高线粒体呼吸功能。综合分析,百可利能够抑制氧化应激,改善线粒体功能,抑制细胞凋亡,从而发挥神经保护作用。