机体在遇到各种不利的刺激后,会通过调节神经-内分泌系统而产生一系列反应,谓之应激。应激会扰乱生理或心理状态,使机体进入亚健康状态或衰老过程,严重的可能进展为疾病[1,2]。与应激相关的临床疾病并不罕见,在生殖内分泌疾病如月经失调、无排卵月经、闭经、不孕、性功能障碍等,慢性应激已经成为重要的致病因素[3,4]。因此,探讨慢性应激致性腺轴失调的发病机制,寻找其防治的潜在靶点是目前迫切需要解决的临床难题。Kisspeptin/GnRH信号途径在生殖内分泌系统中发挥着重要的作用。Kisspeptin由Kiss-1基因编码产生,是视磺酸家族的一种神经肽,广泛分布在脊椎动物的各种器官组织。人类青春期的启动与促性腺激素释放激素(GnRH)神经元激活有关,大量研究表明,Kisspeptin是促进GnRH神经元分泌的关键。同时,在调节促性腺激素LH和FSH的释放、促进生殖器官的发育中,Kisspeptin也具有重要的作用[5]。研究表明Kisspeptin注射入雌、雄性大鼠后,可以急剧增加其垂体门脉中LH和FSH的释放,而GnRH拮抗剂可以阻断这种促分泌作用[6,7]。在人体,研究者发现男性不育症患者血清Kisspeptin水平明显低于正常男性[8]。由于工作和生活压力大,许多人都处在慢性应激状态,加之不孕不育症的患病率逐年呈上升趋势。因此,在本研究中我们首先检测夜班人群生殖激素水平,并采用人工光照使雄性大鼠处于慢性应激状态,并检测其血清及下丘脑中Kisspeptin、GnRH、炎症因子HMGB1的表达水平是否改变,探讨光照应激对性腺轴的影响。材料与方法:1.临床人群研究研究人群:选取2013年安徽医科大学第一附属医院健康体检女性职工98人,入选标准如下:(1)年龄<40岁;(2)子宫附件超声未见异常;(3)妇科检查未见异常;(4)近6个月无性激素治疗史;(5)签署知情同意书者。将这98人进行职业分析后分为夜班组(NS组51例)和非夜班组(WT组47例)。收集研究人群病史资料,检测生殖激素水平:对98人进行问卷调查,同时检测月经周期第3天生殖激素水平。2.动物研究:实验动物:由安徽医科大学动物实验中心提供的雄性SD大鼠(避免雌性大鼠生殖激素的周期性变化)。动物模型的建立和分组:将40只雄性SD大鼠随机分为4组:(1)正常对照组:N组(10只);(2)持续光照组:C组(10只);(3)间断光照组:I组(10只);(4)昼夜颠倒组:R组(10只)。干预方法:(1)正常对照组:模拟正常昼夜节律(光照时间:黑暗时间=12 h:12 h)。(2)持续光照组给予持续光照10天(40W日光灯直射,距离约2.5m),可自由进食。(3)间断光照组给予同等强度光照每3天1次,一次时间为24小时。(4)昼夜颠倒组为晚6点至早6点持续同等强度光照,早6点至晚6点避免一切光照,放至黑暗环境。在实验第11天,采集大鼠的静脉血样本,通过ELISA法测定生殖激素及HMGB1、IL-2、IL-6、TNF-α。下丘脑标本:一份甲醛溶液中固定,制备石蜡切片;另一份用于RNA提取(置于液氮中保存),一份立即提取蛋白。3.指标测定⑴血清HMGB1、IL-2、IL-6、TNF-α测定采用ELISA法测定血清HMGB1、IL-2、IL-6、TNF-α水平。免疫组织化学将石蜡包埋的下丘脑组织制成4μm系列切片,在二甲苯中脱蜡,在梯度稀释的乙醇中水化;抗原修复后温孵1h,切片分别滴加Kisspeptin和GnRH单克隆抗体孵育2h,显色后显微镜下观察,并通过Image J软件计算阳性反应区域光密度,所有切片重复染色3次,计算平均阳性反应区域光密度。⑵Real-time PCR检测Kisspeptin和GnRH m RNA的表达水平以总RNA为模板按照Transcriptor First Strand c DNA Synthesis Kit说明书逆转录合成c DNA。按照Fast Start Universal SYBR Green Master说明书操作在罗氏Light Cycler?480实时荧光定量PCR系统上进行Real-time PCR反应。⑶Western Blot提取新鲜的下丘脑组织蛋白,测定蛋白浓度,Kisspeptin和GnRH单克隆抗体孵育过夜,ECL显色5min,在化学发光成像系统中拍摄照片,采用Image J软件进行条带的灰度值分析。统计学分析使用SPSS16.0软件对实验结果展开数据处理与分析,最终数据采用均值±标准差((?)±s)的形式表达。对不同组数据间比较展开t检验,两组以上则采用方差分析,使用Pearson分析数据间的相关性,P<0.05在统计学上有显著意义。结果1.临床部分:通过调查问卷资料我们发现:夜班组(NS组51例)中痛经比例(33.33%)、月经周期延长(>35天)比例(27.45%)均高于非夜班组(WT组47例)的痛经比例(17.02%)和月经周期延长比例(17.02%)。夜班组和非夜班组之间相比,前者LH、FSH、E2水平均有降低,且有统计学意义(P<0.05)。2.动物实验部分:⑴血清检测指标的变化:持续光照组(C组)、昼夜颠倒组(R组)与正常对照组(N组)相比,FSH、LH、T水平降低(均P<0.05),HMGB1、IL-6、TNF-α水平增高,差异有统计学意义(均P<0.05)。与正常对照组相比,间断光照组(I组)FSH、LH、T水平降低,HMGB1、IL-2、IL-6、TNF-α水平增高,差异无统计学意义(P>0.05)。⑵免疫组化:Kisspeptin和GnRH在下丘脑中的表达所有大鼠下丘脑中均能检出Kisspeptin和GnRH表达,细胞质中着色。但持续光照组和昼夜颠倒组与对照组相比胞质着色较浅且阳性细胞数量明显减少(P<0.05),间断光照组与对照组相比,无显著性差异(P>0.05)。⑶Kisspeptin和GnRH m RNA在下丘脑中的表达水平(1)与对照组相比,持续光照组和昼夜颠倒组Kisspeptin和GnRH m RNA表达水平显著下降(P<0.05),间断光照组与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。(2)与对照组相比,持续光照组和昼夜颠倒组HMGB1 m RNA的表达水平增加(P<0.05),间断光照组与对照组无显著性差异(P>0.05)。⑷Western Blot结果(1)与对照组相比,持续光照组和昼夜颠倒组Kisspeptin和GnRH明显减少(P<0.05),间断光照组与对照组相比,无显著性差异(P>0.05)。(2)与对照组相比,持续光照组和昼夜颠倒组HMGB1的表达水平显著增加(均P<0.05),间断光照组与对照组相比,无显著性差异(P>0.05)。⑸相关性分析将HMGB1、TNF-α、IL-2、IL-6与GnRH、Kisspeptin作直线相关关系分析,可见持续光照组和昼夜颠倒组HMGB1、TNF-α、IL-2、IL-6与GnRH有线性负相关关系(r=-0.618,r=-0.713,r=-0.727,r=-0.773 P<0.05);HMGB1、TNF-α,IL-2,IL-6Kisspeptin有线性负相关关系(r=-0.725,r=-0.721,r=-0.714,r=-0.746 P<0.05)。结论光照应激可能在生殖功能障碍发病过程中起到一定作用。人工光照引起的慢性应激可能会通过增加HMGB1的表达水平,抑制大鼠下丘脑Kisspeptin和GnRH表达水平,影响下丘脑-垂体-性腺轴,导致内分泌机制紊乱。