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目的:通过体内外实验研究双氢杨梅树皮素(Ampelopsin,APS)对多重耐药金黄色葡萄球菌的抗菌作用,以明确APS逆转多重耐药金黄色葡萄球菌耐药作用机制,为寻找有效治疗多重耐药金黄色葡萄球菌感染的药物提供理论依据。方法:1.采用多步诱导法和琼脂平皿二倍稀释法,以青霉素为对照,通过测定诱导前后MIC,以评价标准SA是否容易对APS产生耐药。2.体外抗菌实验:(1)6株临床分离SA进行药敏实验及mec A基因检测,以判定6株菌株耐药类型。(2)采用二倍肉汤稀释法测定APS对6株临床分离SA的MIC、MBC。(3)APS预处理6株临床分离SA后进行常用抗菌药物药敏实验,以筛选有效受试菌株。(4)采用棋盘稀释法测定青霉素、四环素、庆大霉素、氯霉素4种抗生素对APS预处理前后受试菌株的MIC、MBC及分别与APS联用的FICI值,以筛选APS有效逆转耐药抗生素。(5)通过一步法RT-PCR检测APS单用及分别联用青霉素、庆大霉素对β-内酰胺类耐药基因(bla Z、bla I、bla R1)、氨基糖苷类耐药基因(aac(6’)-aph(2")、ant(4’)-Ia、aph(3′)-Ⅲ)、主动外排耐药基因(qac A/B、nor A、)的表达水平的影响。3.体内抗菌实验:(1)采用试管培养法及吸光度法检测在不同的培养时间菌液的A600,平板菌落计数法得出菌浓度,然后绘制多重耐药SA的生长曲线。(2)腹腔注射Mul-1菌株建立小鼠多重耐药SA腹腔感染模型,通过平板菌落计数检测腹腔液活细菌数、白细胞分类计数、ELISA法测定IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、IL-12、IFN-γ水平,以观察APS对腹腔感染多重耐药SA小鼠的保护作用。结果:1.敏感的标准SA体外诱导12d后,对32×MIC浓度下的青霉素产生耐药,对APS未产生耐药。2.体外抗菌实验结果:(1)药敏实验及mec A基因检测结果表明,Mul-1、Mul-3、Mul-4为多重耐药SA,Mul-2为单一耐药SA,Mul-5、Mul-6为多重耐药MRSA。(2)二倍稀释法测定APS对6株临床分离SA的MIC或MBC分别为125μg/m L、62.65μg/m L、125μg/m L、125μg/m L、62.5μg/m L、62.5μg/m L。(3)选择Mul-1为受试菌株。(4)棋盘稀释法测定青霉素、四环素、庆大霉素、氯霉素对Mul-1菌株的MIC值分别为29.25μg/m L、40μg/m L、40μg/m L、78.13μg/m L,MBC值分别为117μg/m L、320μg/m L、160μg/m L、>1250μg/m L;15.625μg/m L APS分别与青霉素、四环素、庆大霉素、氯霉素联用对多重耐药SA的FICI分别为0.37、0.63、1.13、1.13,31.25μg/m L APS分别与4种抗生素联用FICI分别为0.50、0.38、1.25、0.75,62.5μg/m L APS分别与4种抗生素联用FICI分别为0.51、0.63、0.53、0.56;1/2MIC、1/4 MIC、1/8 MIC APS分别预处理Mul-1菌株24h、48h、72h后,青霉素、四环素、庆大霉素、氯霉素的MIC、MBC、FICI值整体上无影响。(5)PCR结果表明,31.25μg/m L和15.625μg/m L APS单用、3.66μg/m L和0.915μg/m L青霉素单用、15.625μg/m L APS与1.83μg/m L青霉素联用、7.813μg/m L APS与0.915μg/m L青霉素联用能明显降低bla Z基因的表达;31.25μg/m L APS单用、15.625μg/m L APS与1.83μg/m L青霉素联用、7.813μg/m L APS与0.915μg/m L青霉素联用能显著降低bla I基因的表达,15.625μg/m L APS单用、3.66μg/m L及0.915μg/m L青霉素单用能明显升高bla I基因的表达;31.25μg/m L和15.625μg/m L APS单用、0.915μg/m L青霉素单用、15.625μg/m L APS与1.83μg/m L青霉素联用、7.813μg/m L APS与0.915μg/m L青霉素联用能明显降低bla R1基因的表达,3.66μg/m L和1.83μg/m L青霉素单用能显著性升高bla R1基因的表达;15.625μg/m L、7.813μg/m L APS单用及10μg/m L、5μg/m L庆大霉素单用能明显升高aac(6’)-aph(2")基因的表达,31.25μg/m L APS与20μg/m L庆大霉素联用、15.625μg/m L APS与10μg/m L庆大霉素联用显著降低aac(6’)-aph(2")基因的表达;31.25μg/m L APS单用及31.25μg/m L APS与20μg/m L庆大霉素联用能明显降低ant(4’)-Ia基因的表达量;对aph(3′)-Ⅲ基因,未见表达,药物处理后也为诱导其表达;31.25μg/m L APS单用、庆大霉素单用、15.625μg/m L APS与1.83μg/m L青霉素联用及7.813μg/m L APS与0.915μg/m L青霉素联用、15.625μg/m L APS与10μg/m L庆大霉素联用、7.813μg/m L APS与5μg/m L庆大霉素联用能明显降低nor A基因的表达,青霉素单用均能明显升高nor A基因的表达;31.25μg/m L与15.625μg/m L APS单用、1.83μg/m L与0.915μg/m L青霉素单用、庆大霉素单用、15.625μg/m L APS与1.83μg/m L青霉素联用及7.813μg/m L APS与0.915μg/m L青霉素联用、15.625μg/m L APS与10μg/m L庆大霉素联用、7.813μg/m L APS与5μg/m L庆大霉素联用均能降低qac A/B基因的表达;对msr A基因,未见表达,药物处理后也未诱导其表达。3.体内实验结果表明,模型组小鼠腹腔液检测中可以看出模型组腹腔液中白细胞显著性升高(P<0.01),其分类中以中性粒细胞、嗜酸性粒细胞最为明显,给药组白细胞均显著高于模型组,模型组小鼠分泌的TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-12炎症细胞因子水平的显著性升高(P<0.05)、模型组小鼠腹腔液细菌数显著性的升高(P<0.01),使得机体炎症启动。而给药组大部分均能显著降低腹腔感染小鼠腹腔液中炎症因子的水平,且细菌数显著减少。结论:APS不易诱导标准SA产生耐药,与青霉素、四环素、庆大霉素、氯霉素联用体外具有协同或相加抗菌作用。APS分别与青霉素、庆大霉素联用通过调控相关耐药基因及主动外排耐药基因的表达而逆转多重耐药SA的耐药性,从而恢复抗生素敏感性。在体内腹腔感染多重耐药SA小鼠,APS可通过调节白细胞中中性粒细胞、单核巨噬细胞、嗜酸性粒细胞等细胞数量,降低腹腔感染小鼠腹腔液中TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-12的水平,从而增强机体免疫应答功能,提高机体对细菌的消除及抑杀能力,达到防御多重耐药SA感染的作用。