论文部分内容阅读
类风湿关节炎是一种以慢性侵蚀性关节炎为特征的全身性自身免疫病。其病理特点是关节滑膜的慢性炎症、血管翳形成。研究表明，Wnt信号通路同类风湿关节炎引起的骨代谢改变有着密切的联系，在类风湿关节炎患者病情发展中，Wnt信号途径受抑，进而抑制了成骨细胞增殖、分化，促进了骨质疏松、骨质侵蚀的发展。近几年，Rspo1（R-脊椎蛋白1）作为Wnt信号通路的激活剂被研究甚多，但不清楚它能否通过激活Wnt信号通路作用于成骨细胞。目前尚无有效的措施来改善和延缓类风湿关节炎骨侵蚀病情的进展，明确其骨侵蚀发生机制可为类风湿关节炎骨侵蚀的临床治疗提供科学依据。一、研究目的本实验通过构建含有TCF荧光素酶报告基因的C2C12细胞，检测其在Rspo1、Wnt-3a等刺激下，骨保护素、碱性磷酸酶及胞内β-catenin蛋白含量的变化，以研究Rspo1是否通过Wnt信号通路来促进成骨细胞分化，从而为防治类风湿关节炎骨侵蚀增添新理论和新手段。二、研究方法采用DMEM培养基对C2C12细胞进行原代培养和传代培养。将扩增了的C2C12细胞进行计数，以4×104/ml的浓度加入48孔培养基中继续培养备用。首先，采用Roche公司xCELLIgence技术的细胞动力学模型分析系统，研究Rspo1及Wnt3a对C2C12细胞增殖的影响。其次，应用Lipofectamine2000将TCF报告质粒及pRL-SV40报告质粒共转染入C2C12细胞，继续培养。接着，我们通过检测骨成熟标志物碱性磷酸酶、骨保护素来验证Rspo1对C2C12细胞的作用。处理组细胞加入50ng/ml的Rspo1刺激因子，空白对照组为空，采用ELASA检测法，收集各组细胞上清液测骨保护素水平，裂解各组细胞测胞内碱性磷酸酶水平。随后增加了50ng/ml Wnt3a组和50ng/ml Rspo1+50ng/ml Wnt3a组，同样采用ELASA检测法，收集各组细胞上清液测骨保护素水平，裂解各组细胞测胞内碱性磷酸酶水平，并采用SPSS17.0统计软件对数据进行方差分析。β-catenin蛋白是Wnt信号通路中的关键蛋白，其进入核内后可与TCF质粒相结合，从而激活下游靶基因的转录。通过对TCF荧光素酶报告基因和β-catenin蛋白的检测可反应Wnt信号通路的激活状态。接着， C2C12细胞转染入TCF报告质粒及pRL-SV40报告质粒6h后，更换含不同浓度的Rspo1、Wnt3a及两者都有的新鲜完全培养基，24h后应用Promega公司的双荧光素酶报告基因检测系统检测报告基因转录活性。最后，我们对50ng/mlRspo1组、50ng/ml Wnt3a组、50ng/ml Rspo1+50ng/ml Wnt3a组以及空白对照组细胞的β-catenin蛋白进行Western blot检测，并进行统计学分析。三、结果1. xCELLIgence系统检测显示Rspo1对C2C12细胞增殖没有影响，Wnt3a对C2C12细胞增殖有促进作用。2.在50ng/ml Rspo1组与空白对照组两组之间，使用碱性磷酸酶检测试剂盒检测碱性磷酸酶、 Elisa试剂盒检测骨保护素，Rspo1组可上调碱性磷酸酶活性、促进骨保护素的分泌，进行方差分析，两组之间有显著性差异，P＜0.05，具有统计学意义。3.在50ng/mlRspo1组、50ng/ml Wnt3a组、50ng/ml Rspo1+50ng/ml Wnt3a组以及空白对照组四组之间，同样检测碱性磷酸酶、骨保护素，两两之间进行分析。50ng/ml Rspo1组与空白对照组比较，结果同结果2一样；50ng/ml Wnt3a组与空白组比较，两组之间有显著性差异，P＜0.01；50ng/ml Wnt3a组与50ng/mlRspo1+50ng/ml Wnt3a比较，两组之间有显著性差异，P＜0.01。4.检测被浓度递增的Rspo1、Wnt3a及两者共刺激处理下细胞的报告基因活性，根据绘制曲线图，可发现Rspo1对TCF报告质粒激活作用不明显；Wnt3a可激活TCF报告质粒，并且呈剂量依赖性；Rspo1和Wnt3a联合则有协同作用。5.对50ng/mlRspo1组、50ng/ml Wnt3a组、50ng/ml Rspo1+50ng/ml Wnt3a组以及空白对照组四组之间胞内的β-catenin进行Western Blot检测，根据蛋白电泳条带颜色从深到浅排列顺序为50ng/ml Rspo1+50ng/ml Wnt3a组、50ng/ml Wnt3a组、50ng/mlRspo1组、空白对照组；50ng/mlRspo1组与空白对照组比较，蛋白条带颜色稍深、柱状图稍高，但两组之间无显著性差异，P＞0.05；50ng/ml Wnt3a组与空白对照组比较，有显著性差异，P＜0.05；50ng/ml Rspo1+50ng/ml Wnt3a组与50ng/mlWnt3a组比较，有显著性差异，P＜0.05。四、结论1. Rspo1并不能促进C2C12细胞的增殖；2.Rspo1可协同Wnt3A促进C2C12细胞向成骨细胞分化，表达碱性磷酸酶、骨保护素；3.单独Rspo1对Wnt信号通路激活作用不明显；4.Rspo1协同Wnt3A活化Wnt/β-catenin信号通路，通过协同激活该通路参与骨代谢，促进成骨细胞分化。