布鲁氏菌病是一种在世界范围内都有广泛流行的危害严重的人畜共患病。世界统计资料表明,每年因布鲁氏菌病造成的经济损失近30亿美元,我国就新疆、青海两地,每年因布鲁氏菌病造成的直接经济损失达一亿元。而且它引起的人类波浪热、慢性感染以及反刍动物流产和睾丸炎等,至今尚无根治方法。此外,布鲁氏菌还被用作生物战剂,也可能被恐怖主义用来制造恐怖事件。由此可见,布鲁氏菌病对我国经济建设、人民健康生活、国家安全等存在着严重的威胁。约在80年代中期,世界布鲁氏菌病疫情开始回升,现已有40-50个国家和地区人、畜布鲁氏菌病疫情出现不同程度的波动。布鲁氏菌病疫情回升的地区主要集中在非洲、亚洲、南美洲和部分欧洲地区。近两年来,我国布鲁氏菌病的发病率已经超过历史最高水平,已引起我国政府的高度重视。布鲁氏菌是布鲁氏菌病的病原体,它是一种胞内寄生的细小的球状杆菌,呈革兰氏染色阴性,无芽抱,有荚膜,无鞭毛不能运动,不呈两极染色。布鲁氏菌为呼吸型代谢,专性需氧,最适生长温度为37℃,最适生长的pH值为6.6-7.4。根据抗原性和主要宿主的不同,布鲁氏菌分为6种,19个生物型,其中对人致病的主要有羊种布鲁氏菌(B.melitensis)、牛种布鲁氏菌(B.abortus)和猪种布鲁氏菌(B.suis)。最近,在海洋哺乳动物体内分离到不同类型的布鲁氏菌,扩大了布鲁氏菌的宿主范围,这也许表示还存在不同种型的布鲁氏菌。在我国流行的主要是牛、羊、猪种布鲁氏菌,其中牛种布鲁氏菌(B.abortus)和羊种布鲁氏菌(B.melitensis)主要引起牛和羊的流产和不孕。人布鲁氏菌病主要是来源于动物的布鲁氏菌病,是在与动物的接触过程中感染的。布鲁氏菌可通过完整皮肤粘膜进入宿主体内,不仅侵袭力强并在体内有很强的繁殖和扩散能力,这与该菌产生的透明质酸酶及荚膜的抗吞噬作用有关。细菌侵入人体后,被吞噬细胞吞噬,由于本菌具有荚膜,能抵抗吞噬细胞的吞噬杀灭,并能在该细胞内增殖。布鲁氏菌经淋巴管至局部淋巴结,待繁殖到一定数量后,突破淋巴结屏障而进入血流,反复出现菌血症。由于内毒素的作用,病人出现发热、无力等中毒症状,随后细菌随血液侵入脾、肝、骨髓等细胞内寄生,血流中细菌逐步消失,体温也逐渐消退。细菌在细胞内繁殖至一定程度时,再次进入血流又出现菌血症,体温再次上升,反复呈波浪热型。由于布鲁氏菌主要在细胞内寄生,不被抗体消灭,也不受药物作用,治疗难于彻底,易转为慢性及反复发作,在全身各处引起迁徒性病变,并容易转成慢性,可迁延1-20年。布鲁氏菌病的发病特点是,一旦发病并转入慢性就无法根治,因此,布鲁氏菌病的预防对于控制布鲁氏菌病是第一位的。布鲁氏菌病的预防主要通过接种疫苗实现的。现有的畜用减毒活疫苗有S19、104M、S2、M5和RB51等,死疫苗有牛种布鲁氏菌45/20,羊种布鲁氏菌H38等,人用活疫苗主要有19-B和104M等。现有的疫苗种类有死疫苗、减毒活疫苗等,但是应用效果比较好的还是减毒活疫苗,其它种类的疫苗虽也有人尝试,但效果均不好。我国目前使用比较广泛的减毒活疫苗株有羊种布鲁氏菌减毒疫苗株M5,猪种布鲁氏菌减毒疫苗株S2,以及牛用疫苗S19等,其中M5疫苗株是我国驯化出来的一株弱毒株,在我国的应用广泛,使用效果很好。在这些疫苗株的使用中还发现,它们具有交叉免疫保护效果。例如,用羊种的M5来免疫牛和猪,也能获得较好的免疫保护效果。也有用S2来免疫羊和牛,发现产生较好的免疫保护。现有减毒活疫苗的广泛使用,对于预防布鲁氏菌病的发生、防止疫情进一步蔓延以及疫源地扩大等方面起到了关键性的作用。我国曾一度将布鲁氏菌病控制得很好,就是得力于大范围的使用疫苗预防的结果。但是,在这些疫苗使用过程中,也发现了一些问题,例如,现有的布鲁氏菌疫苗株虽然免疫保护效果较好,但是仍然存在着一定毒力,仍有偶发的免疫后发病。在一些地区,使用疫苗后发病率反而有上升。另一个比较重要的缺点是,由于减毒活疫苗在抗原上与毒株没有大的区别,而布鲁氏菌病监测和检疫中主要采取的又主要是免疫学的方法,因此,无法区分是自然感染还是疫苗免疫,这就很难得出正确的监测和检疫的结果,给检测和检疫带来很大的困难。如何解决现有疫苗的这些问题,对于布鲁氏菌病的防控具有重要的意义。BP26是布鲁氏菌的一个非常重要的诊断抗原,已有很多用此抗原来进行布鲁氏菌诊断的报道。BP26抗原作为布鲁氏菌的一个表面抗原,在布鲁氏菌的致病性中有一定的作用,但不是一个非常强的保护性抗原。BP26的这个特性,为我们进行研究基因标记疫苗研究提供了很好的靶标。如果将该抗原进行缺失标记,一方面可能将标记株的毒力降低,另一方面也为建立鉴别诊断方法提供标识序列。因此,本项目拟利用同源重组的方法,对减毒活疫苗株进行改造,缺失BP26抗原基因,构建成为BP26的基因标记疫苗株。对得到的疫苗株在细胞和小鼠水平上进行毒力的初步评价,证实其仍能在胞内和体内生存。然后,根据标记疫苗株、野生疫苗株和不同种的毒株在DNA水平上的差异,建立鉴别诊断的方法,区分是疫苗免疫还是自然感染,以及是哪一种布鲁氏菌引起的感染。通过这些研究,一方面可以达到进一步提高疫苗免疫保护效果的目的,另一方面,建立能够区分疫苗免疫和自然感染的鉴别诊断,也为进一步建立血清学监测方法,为更好地监测、预防和控制布鲁氏菌病奠定基础。根据我们以上的这些设想和目标,开展了以下两个方面的研究:一、BP26基因标记疫苗株的构建及初步分析选择我国自主研制的减毒活疫苗株M5,以BP26诊断抗原基因为靶标基因,运用同源重组的原理,用抗性替换的方法构建缺失BP26抗原基因的标记疫苗株。首先分别扩增待缺失BP26基因的N端和C端同源臂,利用本室构建的pUC19K质粒,先将N端同源臂插入到pUC19K中卡那抗性基因N端的多克隆位点,得到pUC19K-N,然后再将C端同源臂克隆到卡那抗性基因的C端的同源臂,得到突变盒质粒pUC19K-NC。将pUC19K-NC转入到M5感受态细胞中,涂卡那抗性TSA平板,在37℃培养3-5天,筛选抗性克隆。利用分别位于卡那抗性基因内部和同源臂外侧的引物组合进行PCR鉴定并进行测序确认,结果显示,利用卡那抗性基因正确替换了BP26基因,成功构建了减毒活疫苗株的BP26抗原基因的标记疫苗株。利用标记疫苗株与野生株感染小鼠巨噬细胞,比较二者在巨噬细胞内的生存能力,结果显示,与原疫苗株相比,标记疫苗株仍能在胞内生存,但生存能力略有降低。分别用等量的标记疫苗株和野生株感染BALB/C小鼠,在感染后的1周和2周,从感染小鼠的脾脏分离细菌,系列稀释后涂板计数,结果显示,标记疫苗株仍能在小鼠体内存活,但与野生株相比,分离出的标记疫苗株比野生株少,表明标记疫苗株的毒力有一定降低。通过以上实验,我们构建了BP26的基因标记疫苗株,细胞实验和动物实验结果表明,标记疫苗株仍能在胞内和小鼠体内存活,具备作为减毒活疫苗株的特性,同时,与原疫苗株相比,毒力减弱了,提示我们构建的基因标记疫苗株副作用可能会更低,这为进一步评价标记疫苗株的免疫保护效果和疫苗的研发奠定了基础。二、针对基因标记疫苗株的鉴别PCR方法研究根据宿主范围及致病特点的不同,布鲁氏菌主要分为6个种,即牛、羊、猪、犬、绵羊附睾种和沙林鼠种等,其中对人致病的主要是牛、羊和猪种。因此,牛、羊和猪种布鲁氏菌的检测与鉴别是最主要的。在这部分研究中,我们首先以属特异的标识基因为靶标基因,建立布鲁氏菌属的定量PCR。然后,根据3个最主要的布鲁氏菌种,建立了能够区分牛、羊和猪3个种的多重PCR。最后,根据标记疫苗株与野生疫苗株序列上的差异,建立了能够区分标记疫苗株的双重PCR方法。BP26基因是在各个布鲁氏菌种中都很保守的一个抗原基因,也是一个非常重要的诊断标识基因。本研究中,我们首先选择BP26作为属特异的标识基因,设计了引物和探针,以M5的基因组为模板,扩增BP26基因的片段,将PCR产物克隆到pET-32a载体得到pET-32a-BP26,以该质粒作为的阳性对照。通过摸索Mg2+离子和探针的浓度,确立了优化的PCR反应体系,建立了基于BP26的Taqman探针法的鉴定布鲁氏菌属的定量PCR方法。根据IS711插入序列在牛、羊和猪种布鲁氏菌基因组中插入位置的差异,设计了4条引物,其中3条上游引物分别位于牛、羊和猪种基因组中特异的位置,而1条共同的下游引物位于IS711的内部,利用4条引物组成多重PCR反应体系,经过优化引物的浓度配比,建立了能够区分3个主要感染人的布鲁氏菌种的三重PCR方法。最后,根据标记疫苗株中缺失的序列设计一对引物,再针对布鲁氏菌的保守基因DnaK设计了一对引物,由2对引物组成双重PCR,对野生株和标记疫苗株进行区分,结果野生株能够扩增出2条带,而突变株因BP26基因的缺失,只能扩增出1条带,实现了区分野生株和标记疫苗株的目的。