【摘 要】
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干旱是影响作物生长及产量的主要非生物胁迫之一。深入研究玉米耐旱分子机制,挖掘抗旱新基因,是提高玉米产量和保障国家粮食安全的重要途径。近年来,大量研究证明了mi RNA、si RNA和lnc RNA（long nocoding RNA）等非编码RNA在植物逆境响应中具有重要作用,但其中大部分研究集中在mi RNA和si RNA上,对lnc RNA功能研究较少。自然反义转录本（Natural anti
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干旱是影响作物生长及产量的主要非生物胁迫之一。深入研究玉米耐旱分子机制,挖掘抗旱新基因,是提高玉米产量和保障国家粮食安全的重要途径。近年来,大量研究证明了mi RNA、si RNA和lnc RNA（long nocoding RNA）等非编码RNA在植物逆境响应中具有重要作用,但其中大部分研究集中在mi RNA和si RNA上,对lnc RNA功能研究较少。自然反义转录本（Natural antisense transcripts,NATs）是一类重要的lnc RNA,可在表观遗传、转录以及转录后水平等多层面调控基因表达,参与植物成花转变和逆境胁迫等生物学过程。在课题组前期对玉米干旱胁迫应答NATs鉴定的基础上,本研究利用链特异性RT-PCR方法,证明了在ZmNAC48和ZmWRKY30基因位点的确存在NATs,分别命名为cis-NATZmNAC48和cis-NATZmWRKY30。干旱条件下,玉米叶片中ZmNAC48、ZmWRKY30、cis-NATZmNAC48和cis-NATZmWRKY30表达量显著增加,且cis-NATZmNAC48和ZmNAC48表达量显著正相关。主要研究结果如下:1、cis-NATZmNAC48的功能分析RNA荧光原位杂交（RNA fluorescence in situ hybridization,RNA-FISH）表明,ZmNAC48及cis-NATZmNAC48可同时在同一细胞核中表达。在玉米原生质体中瞬时过表达cis-NATZmNAC48和烟草叶片中瞬时共表达cis-NATZmNAC48和ZmNAC48,发现cis-NATZmNAC48可负调控ZmNAC48。Western blot和ribosome profiling结果表明,cis-NATZmNAC48缺乏蛋白编码潜能。小RNA测序及茎环法RT-q PCR结果表明,cis-NATZmNAC48与ZmNAC48基因重叠区域有si RNA富集。RNA-pulldown结合蛋白质质谱分析表明,cis-NATZmNAC48可能与光合作用关键酶PPDK相互作用。在拟南芥和玉米中进行转基因试验,发现ZmNAC48可能通过调控ABA的合成,促进气孔关闭,降低拟南芥蒸腾作用,从而提高拟南芥的耐旱性;而cis-NATZmNAC48可能通过双链RNA依赖机制负调控ZmNAC48表达进而影响玉米气孔开闭,或通过与C4途径中的关键酶PPDK相互作用参与玉米干旱胁迫及叶片衰老的响应。2、cis-NATZmWRKY30的功能分析通过序列比对和耐旱性分析,我们发现cis-NATZmWRKY30和ZmWRKY30重叠区域存在一个12 bp的插入缺失,与玉米耐旱性相关。为了进一步研究序列突变引起的功能差异,我们在拟南芥和玉米中开展转基因试验,发现cis-NATZmWRKY30AC7729/TZSRW（插入12 bp）是干旱胁迫应答负调控因子,可能通过正调控光合作用相关基因的表达降低玉米叶片衰老;而cis-NATZmWRKY30 AC7643（缺失12 bp）则可能通过负调控光合作用相关基因的表达促进玉米叶片衰老。ZmWRKY30 AC7643（插入12 bp）异源表达不影响拟南芥的耐旱性,却可能通过调控R2R3-MYB类转录因子影响拟南芥分枝发育和抑制玉米愈伤生长;而异源表达ZmWRKY30AC7729/TZSRW（缺失12 bp）则可能通过调控ABA信号传导提高拟南芥耐旱性和抑制气孔关闭。Western blot和ribosome profiling结果表明,cis-NATZmWRKY30AC7729/TZSRW的开放阅读框（ORF2）具蛋白编码潜能,在玉米中过表达ORF2,玉米耐旱性增强。通过分析ZmWRKY30基因位点小RNA分布及cis-NATZmWRKY30过表达玉米中ZmWRKY30剪接情况发现,cis-NATZmWRKY30不参与ZmWRKY30基因转录后水平调控。
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