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硝态氮(NO3-)和铵态氮(NH4+)是植物吸收的两种主要氮源,二者对植物细胞氧化还原状态、光合作用、水分吸收、矿质养分吸收及代谢等生理生化过程都有着不同的效应。研究表明,对于许多蔬菜作物而言,适当比例的铵硝态氮混合营养比单一氮源更能促进植物的生长和对氮素的吸收,并能提高氮素利用效率。但目前对于NH4+在氮素吸收过程中是否存在调控作用及其分子机制还不十分清楚。菜心(Brassica campestris L.ssp.chinensis var.Utilis Tsen et Lee),又名菜薹,为十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种中的一个变种,以幼嫩薹茎和叶片两部分为主要食用器官,是华南地区栽培面积和产量都最大的特产蔬菜,现在全国各地均有栽培。菜心喜硝,在水培条件下以吸收硝态氮为主,极易积累硝酸盐。本论文从NH4+对菜心氮素吸收的调控作用,菜心铵离子转运蛋白家族基因AMT1对不同氮素供应的响应特性以及不同铵硝比下菜心根系表达谱分析等几个方面在分子水平上探究铵态氮对菜心根系吸收氮素的分子调控机制,主要结果如下:1.NH4+对菜心生长和根系吸收氮素的调控作用在等氮水平下设不同铵硝配比处理(0:100,5:95,25:75,50:50)以及等硝水平下增施不同浓度NH4+(0 m M、0.5 m M、1 m M和2 m M)处理,结果表明,与全硝营养相比,菜心在铵硝比为5:95和25:75以及增施0.5 m M和1 m M NH4+处理中的生物量均显著提高,但NH4+占总氮比例达50%时,菜心根系和地上部的生长均受到显著抑制。在4 m M NO3-营养的基础上施加微量NH4+(0.1m M)也能显著提高菜心地上部的生物量,同时还显著促进了根系对氮素的吸收,提高了植株的总氮积累量。2.菜心铵离子转运蛋白基因Bc AMT的克隆及其基本表达特性分析克隆得到了菜心Bc AMT1;1、Bc AMT1;3、Bc AMT1;4和Bc AMT1;5基因的c DNA全长序列,经过序列分析和蛋白结构域预测推测它们均是跨膜蛋白,与细菌铵离子转运蛋白Amt B有相似的结构区域。洋葱表皮亚细胞定位实验表明,四个基因均定位于细胞膜上,而酵母功能互补实验表明4个菜心Bc AMT蛋白均具能使缺陷型酵母31019b在NH4+单一氮源培养基上恢复生长,这表明4个Bc AMT1s蛋白均有NH4+转运活性。Bc AMT1;1、Bc AMT1;3和Bc AMT1;5均在根系中表达量最高,而Bc AMT1;4则在根系中不表达,只在叶片和花朵中有表达。Bc AMT1;1、Bc AMT1;3和Bc AMT1;5在根系中的表达均存在昼夜节律,Bc AMT1;1的表达受光抑制,而Bc AMT1;3和Bc AMT1;5则在高光强下表达上调。3.根系Bc AMT1s基因对不同氮源的响应特性利用q RT-PCR技术对相关基因的表达进行相对定量分析,利用15N同位素示踪法分析根系对NH4+的吸收速率。结果表明,缺氮处理均促进了Bc AMT1;1、Bc AMT1;3和Bc AMT1;5在根系的表达,同时提高了根系对NH4+的吸收能力。恢复供应NO3-后Bc AMT1;1和Bc AMT1;5的表达均显著下调,而Bc AMT1;3的表达变化不大。结合外源供应单一NH4+对菜心根系Bc AMT1s基因的浓度响应曲线(图3.3)和时间响应曲线(图3.4)来看,总体来讲,Bc AMT1;1和Bc AMT1;5的表达在短时间内受NH4+的诱导,长时间高浓度NH4+处理后则表达下调,而Bc AMT1;3则对外源NH4+很敏感,无论菜心植株处于何种氮营养水平下,低浓度或高浓度NH4+处理均短时间内就显著抑制其表达。此外,不同浓度NH4+处理2 h均使菜心根系对NH4+的吸收能力显著降低。与全硝营养相比,短时间(48 h)内混合铵硝态氮处理均显著抑制了菜心Bc AMT1s基因的表达,而不同铵硝比氮源长期(10 d以上)处理实验中,与全硝营养相比,根系Bc AMT1;1、Bc AMT1;3和Bc AMT1;5均是在低NH4+处理下表达水平最高,当NH4+浓度达1 m M以上时表达均受到抑制。4.菜心根系吸收法瞬时表达系统的建立半定量PCR和实时荧光定量PCR的结果均表明本研究成功建立了农杆菌介导的菜心根系吸收法瞬时表达系统,并对转化条件进行了优化,结果表明,不经过高渗处理的菜心植株以OD600=0.3的菌液静置浸染3-9 h可取得较高的转化效率,目的基因在根系的超表达可持续2-4 d,在转化后第6 d,目的基因表达水平开始下降。5.Bc AMT1;3对Bc AMT和Bc NRT基因表达及根系吸收氮素能力的调控瞬时超表达菜心根系Bc AMT1;3显著促进了Bc AMT1;1和Bc AMT1;5以及Bc NRT1;1和Bc NRT2;1在根系的表达均显著上调,同时显著提高了菜心根系对NH4+和NO3-的吸收;反之,抑制菜心根系Bc AMT1;3的表达使Bc AMT1;1、Bc NRT1;1和Bc NRT2;1的表达均显著降低,但菜心根系对NH4+和NO3-的吸收无显著差异。6.不同铵硝配比下,菜心根系转录组分析利用RNA-Seq技术首次获得了菜心的转录组信息,包含53746条unigene序列,其中78.61%的序列在公共数据库得到了注释。同时,对不同铵硝配比(CK:0/100,T1:5/95,T2:25/75,T3:50/50)处理15 d后的菜心根系作了表达谱分析,结果共2242个unigene差异表达,共覆盖了97个KEGG代谢通路,其中有13个显著富集通路,主要包括光合相关代谢途径,植物激素信号传导途径和氮素代谢途径,等。此外,在菜心根系转录中还鉴定了2913个转录因子,其中189个在4个氮素处理间表现出了表达差异。综上所述,NH4+不仅是作为营养物质还很可能作为信号分子调控菜心生长和氮素吸收,且Bc AMT1;3很可能参与了菜心NH4+调控途径,正向调控Bc AMT1;1和Bc AMT1;5以及Bc NRT1;1和Bc NRT2;1在根系的表达以及菜心根系对NH4+和NO3-的吸收,而激素信号途径相关基因及转录因子也广泛参与了根系氮素吸收及代谢调控。