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目的:探究鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,Ab)耐药性与生物被膜(bacterial bioflim,BF)形成能力二者之间的关系以及多种抗菌药物对多重耐药鲍曼不动杆菌(Multiple drug resistant Acinetobacter baumannii,MDR-Ab)生物被膜的影响。内容:本实验研究对象为天津市第一中心医院重症医学科病房分离的鲍曼不动杆菌,标本来源均为痰。实验设计分为两部分:实验一:Ab-BF形成能力测定。根据细菌耐药性不同,将实验分为两组:一组为多重耐药鲍曼不动杆菌组(MDR-Ab),另一组为敏感菌组(sensitive drug Acinetobacter baumanni,S-Ab),每组菌株20株。采用改良平板法于96孔板及24孔板内制备两组标本的BF模型。采用结晶紫染色法(crystal violet staining,CVS),于570nm波长下检测两组规定时间节点即培养8h、12h、24h、48h、72h的吸光度(optical dencity,OD)。并采用扫描电子显微镜法(scanning electron microscope,SEM)观察两组细菌浮游状态及BF状态下的形态与结构特点。实验二:抗菌药物对MDR-Ab生物被膜的干预作用。该部分菌株来源于实验一中生物膜阳性的MDR-Ab。首先,采用微量肉汤稀释法,分别测定多粘菌素(Colistin,CL)、替加环素(Tigecycline,TGC)和亚胺培南(Imipenem,IPM)对MDR-Ab的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)以及生物被膜最低抑制浓度(minimal biofilm inhibitory concentration,MBIC),从而对比分析MIC与MBIC值之间的关系。然后,通过实验测得的MBIC值,干预MDR-Ab生物被膜。该部实验分为四组:A组为阴性对照组,既不加菌液亦无任何抗菌药物;B组为阳性对照组,加菌液有BF生成而无任何抗菌药物;C组为单一抗菌药物组,即阿奇霉素(Azithromycin,AZM)、CL、TGC和IPM;D组为以AZM为基础的联合抗菌药物组,即AZM+CL、AZM+TGC、AZM+IPM。采用CVS法测定A、B、C、D四组的OD值,计算每种抗菌药物及抗菌药物组合对生物被膜的抑制率。从而,筛选出对生物被膜抑制能力较强的抗菌药物及组合以指导临床用药。结果:实验一:MDR-Ab组及S-Ab组在波长为570nm条件下,OD值随时间的延长而增高。MDR-Ab组在培养8h时,OD值开始增高,到达12h时间节点时,差异具有统计学意义(P<0.001)。S-Ab组在培养24h时,OD值开始增高,到达48h时,差异具有统计学意义(P<0.05)。与S-Ab组相比较,MDR-Ab组于各时间点上的OD值均处于较高水平,在12h时间点上,MDR-Ab吸光度显著高于S-Ab组,差异具有统计学意义(P<0.001)。除此之外,在72h时,MDR-Ab生物被膜阳性率为100%,S-Ab生物被膜阳性率为80%,二者差异具有统计学意义(P<0.05)。扫描电镜下观察MDR-Ab与S-Ab二者浮游状态与BF状态的空间结构,二者浮游状态下,菌体均为散在的或成双排列的、无芽孢、两端钝圆的球杆菌,无明显差异;而二者BF状态,菌体周围出现大量丝状或条索状物质,与细菌彼此包绕聚集,融合成片状或团块状,形成具有空间结构的聚集体;MDR-Ab与S-Ab二者BF对比发现,MDR-Ab生物被膜结构更加致密,丝状物质产生更多,菌体发生变形程度更大,空间结构更为复杂,二者具有肉眼可见的差异。实验二:采用微量肉汤稀释法测定CL、TGC、IPM三种抗菌药物对MDR-Ab的MIC值及MBIC值,结果显示MBIC值均显著高于MIC值。其中,CL的MBIC值范围为8~64μg/ml,MIC值范围为0.5~8μg/ml,对比增长8~16个倍比浓度梯度。TGC的MIC值范围为0.5~4μg/ml,MIBC值范围为4~32μg/ml,两者比较增加8个浓度梯度。IPM的MIC值范围为32~256μg/ml,MIBC值为512~1024μg/ml,两者对比增高4~16个倍比浓度。该结果显示了,MDR-Ab生物被膜状态较浮游状态对抗菌药物的耐药性明显增高。然后,利用测得的MBIC浓度抗菌药物单药干预MDR-Ab生物被膜可以发现,TGC对BF抑制率最高,为34.9%,其次CL,抑制率为20.1%,差异具有统计学意义(P<0.05),而单独使用AZM、IPM对BF无明显抑制作用,差异无统计学意义(P>0.05)。以AZM为基础分别联合三种抗菌药物干预MDR-Ab BF结果显示,AZM+CL组合BF抑制率最高,为65.9%,其次是AZM+TGC组,抑制率为52.7%,最后是AZM+IPM,耐药率为39.6%,差异均具有统计学意义(P<0.05)。对比单药与联合用药方案发现,以AZM为基础的联合用药方案对MDR-Ab BF的抑制作用较单一抗菌药物更强,其差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1、通过本实验证实了MDR-Ab生物被膜形成能力较强,形成时间较早,生物膜结构更加致密,空间结构更为复杂。同时,MDR-Ab生物被膜状态较浮游状态对抗菌药物的耐药性显著增加。该实验说明了鲍曼不动杆菌耐药性和生物被膜的形成,二者之间存在着相互促进的正向影响。2、通过本实验证实了,单药CL、TGC对BF有不同程度的抑制作用,其中TGC作用最强;而以AZM为基础分别联合CL、TGC和IPM,对MDR-Ab的生物被膜的抑制率优于相对应的单一抗菌药物,其中AZM联合CL对生物被膜抑制效果最强。