论文部分内容阅读
目的在全球范围内,乳腺癌是女性发病率最高的癌症并位居女性癌症死因首位。作为一种激素依赖性的全身性疾病,目前提倡针对乳腺癌采取手术,放、化疗,内分泌治疗和分子靶向治疗的综合治疗手段,其中以他莫昔芬(Tamoxifen,TAM)为代表的抗雌激素药物是目前最常用的乳腺癌内分泌治疗药物。然而,在进行TAM治疗的过程中,往往会发生耐药现象,这也成为制约乳腺癌内分泌治疗成功的主要障碍。为了提高TAM的疗效,一些实验室对其结构进行了改造,合成了与其结构类似的新型香豆素类化合物,在前期的研究中发现,该类化合物对包括乳腺癌细胞在内的多种肿瘤细胞有很强的抗增殖能力且对正常细胞的细胞毒性较低,但其作用的具体机制有待进一步研究。本课题通过采用Cell Titer 96?AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit(MTS法)、流式细胞术PI染色法、Western blot法及实时定量PCR法(RT-PCR法)检测新型香豆素类化合物对MCF-7乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响,旨在为新型抗肿瘤药物的研发提供理论依据及实验基础。方法常规培养MCF-7人乳腺癌细胞,取对数生长期的MCF-7细胞用于实验。1、MTS法检测不同浓度(0、5、10、15、20μmol/L)的TAM和新型香豆素类化合物作用细胞48h后对增殖的影响,计算并比较两种化合物对MCF-7细胞的半数抑制浓度(IC50);2、流式细胞术PI染色法检测IC50浓度的TAM和新型香豆素类化合物对细胞周期的影响;3、Western blot法和RT-PCR法分别检测两种化合物在各自IC50浓度时作用于MCF-7细胞48h后对Cyclin D1、NF-κB(P65)、p-NF-κB(P65)、Bcl-2、Bax蛋白及其m RNA表达情况的影响。所有实验数据均以均数±标准差((?)±s)表示,并应用SPSS16.0统计软件进行后续处理,均数比较采用t检验或方差分析(ANOVA S-N-K)检验,以P<0.05为差异具有统计学意义。结果1、MTS法结果显示,分别以不同浓度(0、5、10、15、20μmol/L)的TAM和新型香豆素类化合物培养MCF-7细胞48h后,细胞的增殖均受到抑制,且随药物浓度增大抑制作用增强;依据MTS结果得到TAM和新型香豆素类化合物对人乳腺癌MCF-7细胞的IC50值分别为13.72±1.85μmol/L和7.18±1.39μmol/L。2、流式细胞术结果显示TAM和新型香豆素类化合物均可以使G1期细胞增加,S期及G2期细胞减少,且细胞对照组、TAM和新型香豆素类化合物三组之间相比差异具有统计学意义(P值均小于0.05)。3、Western blot和RT-PCR的结果分别提示,在蛋白及m RNA水平,两种化合物均可以使Cyclin D1、NF-κB(P65)、p-NF-κB(P65)及Bcl-2的表达下调并可以上调Bax的表达,且新型香豆素类化合物的作用>TAM>细胞对照组(P值均小于0.05)。结论通过初步研究发现,新型香豆素类化合物可能是通过影响NF-κB信号通路并且调节Cyclin D1及Bcl-2/Bax的表达水平而对MCF-7细胞发挥抑制其增殖并促进其凋亡的作用,且其作用强于TAM(P<0.05)。