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常染色体显性遗传骨硬化症II型(Autosomal dominant osteopetrosis type II,ADO2)是一类以破骨细胞异常为特征的罕见人类遗传性骨疾病。破骨细胞来源于血系多能造血干细胞,它的生存、增殖、分化和激活需要合适的微环境。非编码RNA间的相互作用在破骨细胞分化和功能中起关键作用,然而,其机制尚未完全清楚。本研究通过对常染色体显性遗传骨硬化症II型疾病特异性诱导多能干细胞(ADO2-iPSCs)和正常对照iPSCs(NC-iPSCs)进行全转录组和降解组测序,旨在挖掘与ADO2生理病理相关的mRNAs、lncRNAs、circRNAs和miRNAs,构建其竞争性内源性RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)调控网络,为深入研究石骨症的发病机制提供新思路。本研究以ADO2-iPSCs和NC-iPSCs为主要研究对象,进行细胞免疫荧光染色分析后,提取细胞总的RNA,分别构建了2个lncRNA特异性文库,2个miRNA文库和1个降解组文库,进行深度RNA测序。然后,对所有鉴定到的基因进行GO、KEGG、KOG功能分类注释以及富集分析。最后,通过TargetScan(v.5.0)和miRanda(v.3.3a)预测lncRNA-miRNA、circRNA-miRNA和miRNA-mRNA的靶向关系,利用Cytoscape(v.3.5.0)构建ceRNA调控网络,主要的结果如下:(1)细胞免疫荧光染色结果表明,ADO2-iPSCs和NC-iPSCs均能阳性表达多种多潜能标志基因,如NANOG,OCT4,SOX2和SSEA4。(2)在lncRNA特异性文库测序中,下机数据总共产生了213145700个raw reads(ADO2-iPSCs为106491118个,NC-iPSCs为106654582个),其中203562140个reads为valid reads(ADO2-iPSCs为101521688个,NC-iPSCs为102040452个)。在miRNA文库测序中,ADO2-iPSC文库和NC-iPSC文库分别获得12438447和11722532个raw reads,其中385946和279297个reads为valid reads。此外,在降解组文库测序中,总共检测到63184580个raw reads,其中63053758个reads(99.79%)精确地映射到人类参考基因组(GRCH38)。对两个细胞株进行全转录组测序总共鉴定到133283个mRNAs,16632个lncRNAs,12032个circRNAs和1306个miRNAs。(3)根据|log2(fold change)|>1和p值<0.05,ADO2-iPSCs和NC-iPSCs中存在差异表达的mRNAs 4161个,其中上调2062个,下调2099个;差异表达的lncRNAs164个,其中上调100个,下调64个;差异表达的circRNAs 45个,其中上调19个,下调26个;差异表达的miRNAs 524个,其中上调318个,下调206个。(4)通过TargetScan(v.5.0)和miRanda(v.3.3a)对非编码RNA之间的靶向关系进行预测,成功地构建了ADO2-iPSCs和NC-iPSCs中非编码RNA间的相互调控网络。在lncRNA-miRNA的调控网络中,包括差异表达的lncRNAs 408条,差异表达的miRNAs 164条以及8939 lncRNA-target pairs;在circRNA-miRNA的调控网络中,包括差异表达的circRNAs 45条,差异表达的miRNAs 292条以及579circRNA-target pairs;在miRNA-mRNA的调控网络中,包括差异表达的miRNAs 408条,差异表达的mRNAs 20条以及947 miRNA-target pairs。值得注意的是,我们发现TNFRSF11A、TNFSF11、CSF1、GRB2、TRAF2、TGFBR1等基因在miRNA-mRNA调控网络中被多个miRNA靶向,它们可以共同调控破骨细胞形成的微环境。(5)根据ceRNA理论,成功地构建了ADO2-iPSCs和NC-iPSCs的ceRNA调控网络:1).circRNA-associated-ceRNA调控网络,其中包括10条上调的circRNAs,18条下调的miRNAs和11条上调的mRNAs,以及17条下调的circRNAs,27条上调的miRNAs和8条下调的mRNAs;2).lncRNA-associated-ceRNA调控网络,其中包括94条上调的lncRNAs,42条下调的miRNAs和13条上调的mRNAs,以及60条下调的lncRNAs,54条上调的miRNAs和8条下调的mRNAs。这些ceRNA网络共表达的基因主要参与了RANK/RANKL信号通路、PI3K-Akt信号通路和钙信号通路。(6)在ADO2-iPSC和NC-iPSC的降解组文库测序中,总共检测到329个miRNAs所靶向的7196个mRNA转录本,来源于2316个候选靶基因。结合miRNA文库测序分析,降解组测序验证到了140个差异表达的miRNAs所靶向的1511个靶基因,其中包括119个已知的miRNAs和21个新的miRNAs。有趣的是,我们发现这些候选靶基因主要参与p53信号通路,调控破骨细胞分化,提示它们可能与石骨症发病有关。(7)对全转录组测序中的8个差异表达mRNAs和12个差异表达miRNAs进行了qRT-PCR验证,结果表明:基因的相对表达量与高通量测序的结果基本一致。综上所述,研究结果表明,差异表达的lncRNAs、circRNAs和miRNAs可能作为石骨症的潜在生物标志物,并进一步表明ceRNA调控网络参与破骨细胞的形成与功能。此外,miRNA介导的剪切事件在石骨症中存在,可能为未来ADO2患者的治疗提供有希望的靶点。