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芦笋（Asparagus officinalis L.）是一种深受消费者喜爱的营养保健型高档蔬菜,具有“蔬菜之王”的美誉。芦笋雌雄异株,性别是由位于同型性染色体L5上的一对等位基因（M-m）控制,雄性M-,雌性mm。其雄株因不结种子消耗养分少,产量比同期生长条件的雌株高出25%以上,且寿命长,抗性强,为此全球正在大力开展芦笋全雄育种。芦笋超雄株（MM）与雌株杂交后代全部为雄株（Mm） （MM×mm→Mm）,此过程称之为全雄育种,超雄株的筛选是芦笋全雄育种的关键。然而,超雄株与普通雄株即使在开花期表型上也没有任何差异,且芦笋从播种到开花大约需要2年时间,若利用与芦笋性别决定基因紧密连锁的DNA分子标记辅助选择,苗期快速准确筛选出超雄株,可加快芦笋全雄育种进程,提高育种效率。本研究利用简单重复序列区间多态性（ISSR）、序列相关扩增多态性（SRAP）等DNA分子标记技术结合群体分离分析方法（BSA）对芦笋性别决定基因连锁的DNA分子标记进行筛选、转化研究,这些标记的获得与转化将有助于芦笋性别（包括超雄株）早期快速鉴别和性别决定基因的定位研究。主要研究结果如下：1.首先进行了芦笋基因组DNA的改良CTAB法、SDS法和试剂盒提取方法的比较研究。结果表明：以芦笋嫩绿的拟叶为试验材料,经改良CTAB法提取的DNA完整性好、浓度和纯度都比较高,综合效果优；加入2%PVP和0.1%的巯基乙醇可以去除多糖、多酚类物质和防止褐化现象的发生；在芦笋两性现象调查的基础上,利用两性株自交雌雄分离群体S1代,通过群体分离分析法（BSA）,构建4对B23（Thielim）, B24（Grolim）, B25（Backlim）, B33（Guelph Millenium）雌雄分离后代的DNA池和1770（MM）以及杂交后代品种G190-1（mm）,总共5对DNA池进行性别连锁标记的筛选研究；2.利用单因素分析方法优化了芦笋基因组的ISSR反应条件,得出较优的ISSR反应条件是：25μL反应体系中,基因组DNA 50ng,引物5gmol／L 2μL,dNTP 200μmol/L 2μL, 10×buffer 2.5μL, Mg2+ 25mmol/L2.5μL, Taq酶1U；反应程序是94℃预变性5min；32个循环中变性94℃1min,48℃～53℃复性1min,72℃延伸1min；最后72℃延伸10mim;3.利用构建好的5个品种内的雌雄DNA池作为材料进行ISSR分析,筛选和检测到ISSR3引物在所有5对雌雄DNA池间具有多态性,获得2条多态性片段,克隆测序；结果表明：Asp1全长为778bp,编码4个ORF; Asp2全长是993bp,编码6个ORF。经Blastn比对,没有发现同源相关序列,是新开发的芦笋基因组序列；4.单株验证发现Aspl和Asp2与性别决定基因连锁,根据Aspl测序结果设计了2对特异性引物,将Asp1转化为更稳定的标记SCAR1（F：5’-ATTGCGAGCATTGTAATCTTCTTC-3’,R:5’-TTGTCATTGGATAGGGAGT-3 ’）,SCAR2（F:5’-TCATTGGATAGGGTTGGAGTCGG-3’,R:5’-TGTGCATTTCATC ACCTCGGTCT-3’）, SCAR1能够在芦笋基因组上稳定扩增,与芦笋性别决定基因连锁,并表现为共显性,共显性标记SCAR1的获得将有助于芦笋超雄株（MM）的快捷筛选,经初步雌雄分离单株验证得出准确率是83%；而SCAR2在雌雄群体中都能扩增出来,可作为芦笋特异性标记；根据Asp2测序结果设计了1对特异性引物,将Asp2转化为更稳定的标记SCAR3（F:5’-TACCCCGTATCTTCTGGTGAGTG-3’;R:5’-CGAGTTTTGTGATTC TTTGTGGC-3’）,通过在5对DNA池和12株雌雄单株中验证,SCAR3在雄株DNA中稳定扩增,与芦笋性别决定基因连锁,经初步雌雄分离单株验证得出准确率是90%。5.建立了芦笋基因组DNA的SRAP反应体系：25gL的反应体系中,模板DNA量80ng、Mg2+浓度3.0mmol/L、上下游引物各0.2μmol/L、dNTPs0.3mmol/L、Taq DNA聚合酶1U以及1×Buffer;扩增程序为：94℃预变性3min,反应前5个循环在94℃30s; 35℃30s、72℃1.5min的条件下运行；随后的35个循环退火温度提高到50℃；最后72℃延伸10min。得出6%变性聚丙烯酰胺电泳检测扩增产物效果比琼脂糖检测分辨率高,适合进行SRAP扩增差异片段分析；6.利用该优化体系进行了256对SRAP引物筛选,从中筛选出扩增条带清晰丰富、重复性好的引物组合239个,占整个引物序列的93.36%；回收了引物组合ME3+EM12在品种B23雌雄DNA池内200-500bp间具有多态性的扩增差异条带Asp-3,测序得出序列长度为307bp,经Blastn分析为芦笋新的基因组序列,并将ME3+EM12引物对转化成了SCAR4（F:5’-CCTGTTCCGTTTACTTAGGACAATC-3’,R:5’-GGGTATTATTTGGAGAAGGT GGAG-3’）。SCAR4在各品种的雌雄株之间稳定扩增,但没有多态性。