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目的:乳腺癌前哨淋巴结活检术是确定腋窝淋巴结分期的微创技术,该技术的准确性和安全性已经得到多项临床试验结果的验证。目前,乳腺癌临床实践指南推荐,对于腋窝前哨淋巴结阴性的患者,前哨淋巴结活检术替代腋窝淋巴结清扫术是安全、可行的;对于腋窝前哨淋巴结12枚转移的早期乳腺癌患者,如果接受保乳和术后全乳放疗,也是可以避免腋窝淋巴结清扫的。前哨淋巴结是肿瘤细胞最先转移的第一枚或第一站淋巴结,该淋巴结不仅引流乳腺原发肿瘤区域的淋巴液,而且还引流整个乳腺器官的淋巴液,其转移状况能够为评估腋窝其他淋巴结的转移提供重要参考。腋窝前哨淋巴结与周围组织对比不明显,难以通过肉眼观察进行区分,需要借助示踪剂使前哨淋巴结显现出来,从而定位前哨淋巴结并引导完成前哨淋巴结活检。目前,临床上应用的前哨淋巴结示踪剂包括两大类,一类是非特异性示踪剂,例如蓝染料、放射性核素和荧光示踪剂等;另一类是特异性示踪剂,例如Lymphoseek、99mTc-利妥昔单抗和利妥昔单抗-吲哚菁绿等。这些前哨淋巴结示踪剂仍存在部分缺陷,限制了其在前哨淋巴结活检方面的临床应用和推广。蓝染料示踪剂引导前哨淋巴结活检需要外科医生精湛的解剖技巧和严格的学习曲线练习,但仍会出现较高的前哨淋巴结活检假阴性率;核素示踪剂引导前哨淋巴结活检存在患者和医护人员的放射性损伤,放射性核素制备需要昂贵的仪器设备,部分医院无核医学科难以完成核素示踪剂的配制,核素靶向示踪剂虽然具备靶向定位前哨淋巴结的性能但仍无法摆脱核素制备的限制;荧光示踪剂同样需要外科医生精湛的解剖技巧和严格的学习曲线练习,然而淋巴管内的荧光示踪剂外漏会污染周围组织的荧光显像造成前哨淋巴结漏检和定位不准确,荧光靶向示踪剂虽然具备靶向定位前哨淋巴结的作用但激发荧光的光强度较差难以穿透深部组织。本研究首先将通过化学合成的方法制备新型聚甲川菁染料Cy754,增加菁染料Cy754分子的水溶性,红移菁染料Cy754分子最大吸收波长和最大荧光发射波长,增加其光稳定性和荧光量子产率并增加其斯托克斯位移,并检测新型聚甲川菁染料Cy754的吸收和发射光谱、安全性和发射荧光的光强度等。其次将通过直接偶联反应将新型聚甲川菁染料Cy754与前哨淋巴结靶向试剂利妥昔单克隆抗体进行结合,制备新型荧光靶向示踪剂利妥昔单抗-Cy754。随后将对新型荧光靶向示踪剂利妥昔单抗-Cy754的单抗蛋白分子完整性、免疫活性和菁染料Cy754标记率,同时将检测利妥昔单抗-Cy754的安全性,并将通过大鼠后肢前哨淋巴结动物模型检测新型荧光靶向示踪剂利妥昔单抗-Cy754的前哨淋巴结定位性能。最后将新型荧光靶向示踪剂利妥昔单抗-Cy754与联合法进行对比,通过临床验证进一步明确利妥昔单抗-Cy754的前哨淋巴结定位性能,以及利妥昔单抗-Cy754与联合法在定位前哨淋巴结方面的相关性和一致性。方法:通过化学合成的方法制备新型聚甲川菁染料Cy754,通过分光光度计检测新型聚甲川菁染料Cy754的最大紫外吸收光谱和最大荧光发射光谱,通过无菌培养基检测新型甲川菁染料Cy754内有无细菌成分,通过鲎试剂检测Cy754样品溶液中是否存在细菌内毒素。通过实验大鼠分别检测高剂量、中剂量和低剂量Cy754样品的急性毒性,连续观察确认有无死亡,明确实验大鼠的肝功能和肾功能,检测实验大鼠各脏器中药物残留情况。在相同能量激发光源的条件下,对比新型聚甲川菁染料Cy754与吲哚菁绿发射荧光的光强度和组织穿透力。通过直接偶联反应将新型聚甲川菁染料Cy754与前哨淋巴结靶向试剂利妥昔单克隆抗体进行结合,制备新型荧光靶向示踪剂利妥昔单抗-Cy754。通过双层析快速薄层层析-硅胶层析纸法测定利妥昔单抗大分子蛋白上小分子Cy754的标记率。通过凝胶电泳法检测利妥昔单抗-Cy754中单克隆抗体大分子蛋白的完整性。通过双抗体夹心间接酶联免疫测定法检测利妥昔单抗-Cy754中单抗大分子蛋白的免疫活性。通过无菌培养基检测利妥昔单抗-Cy754样品内有无细菌成分,通过鲎试剂检测利妥昔单抗-Cy754样品溶液中是否存在细菌内毒素。通过实验大鼠分别检测高剂量、中剂量和低剂量利妥昔单抗-Cy754样品的急性毒性,连续观察确认有无死亡,明确实验大鼠的肝功能和肾功能,检测实验大鼠各脏器中药物残留情况。在相同能量激发光源的条件下,对比利妥昔单抗-Cy754与利妥昔单抗-吲哚菁绿发射荧光的光强度和组织穿透力。通过染料法淋巴引流的时间窗来构建大鼠后肢前哨淋巴结模型。通过大鼠后肢前哨淋巴结引流模型对利妥昔单抗-Cy754、利妥昔单抗-吲哚菁绿和菁染料Cy754的前哨淋巴结定位性能进行对比。通过临床研究验证利妥昔单抗-Cy754的前哨淋巴结定位性能（山东省肿瘤医院伦理委员会批准伦理批件号No.SDTHEC201603008）,计划共入组了12例乳腺癌患者,进行利妥昔单抗-Cy754前哨淋巴结显像并引导完成前哨淋巴结活检,并与联合法前哨淋巴结活检进行对比,明确利妥昔单抗-Cy754与联合法在定位前哨淋巴结上的相关性和一致性。结果:经化学合成的新型聚甲川菁染料Cy754为蓝黑色粉末,极易溶于水,水溶液的颜色为靛蓝色,最大紫外吸收波长为754 nm,最大荧光发射波长为795 nm。经过连续1周培养和观察,确定Cy754样品的培养基颜色无变化,也无细菌菌落生长。所有浓度的Cy754样品鲎试剂检测结果均为阴性,符合中国药典2015年版的细菌内毒素检测要求,说明Cy754样品中无细菌内毒素。经过连续观察,高剂量、中剂量和低剂量三组实验大鼠均未发现实验大鼠死亡,各组实验大鼠的肝功能和肾功能未见异常,各脏器（心脏、肝脏、肾脏和肺脏）均未发现Cy754残留。在相同能量激发光源的条件下,新型聚甲川菁染料Cy754的发射荧光强度优于吲哚菁绿,菁染料Cy754的组织穿透力也优于吲哚菁绿。经直接偶联制备的新型荧光靶向示踪剂利妥昔单抗-Cy754为深蓝色液体。经过检测利妥昔单抗大分子蛋白上小分子Cy754的标记率可达99%以上。经过检测确定利妥昔单抗与Cy754发生偶联反应之后仍保持了单抗蛋白分子的完整性。经过检测确定利妥昔单抗与Cy754进行偶联反应之后并未改变其免疫活性。经过连续培养和观察,确定利妥昔单抗-Cy754样品培养基颜色无变化,也无细菌菌落生长。经过灵敏度为0.5 EU/mL的鲎试剂检测后发现,所有浓度的利妥昔单抗-Cy754样品溶液结果均为阴性,符合中国药典2015年版的细菌内毒素检测要求,说明利妥昔单抗-Cy754样品中无细菌内毒素。经过连续观察,确认利妥昔单抗-Cy754无急性毒性,各组实验大鼠的肝功能和肾功能未见异常,各脏器（心脏、肝脏、肾脏和肺脏）均未发现Cy754残留。在相同能量激发光源的条件下,利妥昔单抗-Cy754的发射荧光强度优于利妥昔单抗-吲哚菁绿,利妥昔单抗-Cy754的组织穿透力也优于利妥昔单抗-吲哚菁绿。大鼠后肢前哨淋巴结模型确定大鼠后肢腘窝处淋巴结的位置为后肢前哨淋巴结的位置。大鼠后肢前哨淋巴结引流模型对比研究发现,新型聚甲川菁染料Cy754只能使引流淋巴管染色、显像而无引流淋巴结染色、显像,利妥昔单抗-Cy754能够准确定位前哨淋巴结并可经荧光脉管成像仪经体外引导完成前哨淋巴结活检术,与靶向荧光示踪剂利妥昔单抗-吲哚菁绿相比利妥昔单抗-Cy754具有更好的激发荧光组织穿透力。在临床验证阶段共入组了12例乳腺癌患者,其中11例通过利妥昔单抗-Cy754定位到腋窝前哨淋巴结并通过术中荧光脉管成像仪引导成功完成了前哨淋巴结活检。按照患者病例进行统计分析确定利妥昔单抗-Cy754与联合法在前哨淋巴结定位方面呈显著正相关关系,相关关系密切（rs=0.782且>0.5,P=0.01）,而且两种方法在前哨淋巴结定位上具有较好的一致性（kappa=0.76,P<0.01）。结论:1.新型聚甲川菁染料Cy754具有水溶性好、光稳定性好和荧光量子产率高等优点,与吲哚菁绿相比Cy754的发射荧光强度更强、组织穿透力更好;2.利妥昔单抗与Cy754偶联制备的新型荧光靶向示踪剂利妥昔单抗-Cy754具有较高的Cy754标记率,保持了单抗蛋白的完整性和免疫活性,生物安全性好,与利妥昔单抗-吲哚菁绿相比利妥昔单抗-Cy754发射荧光强度更强、组织穿透力更好;3.新型荧光靶向示踪剂利妥昔单抗-Cy754与联合法一样,能够定位前哨淋巴结并引导前哨淋巴结活检。