感音神经性耳聋足临床常见病和多发病，严重影响人类健康及生活质量，临床上尚无理想的治疗方法，目前关于感音神经性聋的防治研究已成为临床研究的热点和难点之一。　　 各种原因所致螺旋神经节细胞(spiral ganglion neurons,SGNs)的凋亡和变性是感音神经性耳聋发生的主要病理机理。SGNs属分化成熟的神经细胞，易受直接/间接因素的影响而发生死亡(凋亡或坏死)。由于SGNs再生能力非常低，因此，受损SGNs的保护与再生对恢复听力可能起重要作用。干细胞因具有连续增殖能力及定向分化潜能，有可能成为神经细胞损伤替代疗法之一。目前的研究业已证明成熟的哺乳动物内耳同样存在神经干细胞，只是处在不活跃状态。如何促使不活跃的内耳神经干细胞重新进入细胞周期，并向特定的神经元方向分化，是目前存在的关键问题。　　 系列研究表明，控制干细胞增殖和分化的因素十分复杂，可能是多种因素共同作用的结果。microRNA(miRNA)是内源性的大小在19～25bp的一类非蛋白编码RNA，通过与靶mRNA的3'非翻译区域(3'untranslated regions，3'-UTRs)结合，介导基因转录后抑制。人类基因组编码的miRNA多达1000个，通过关键靶基因的负向调节，在发育、分化中发挥重要的作用。在中枢神经系统，miR-132通过对靶基因cAMP效应元件反应结合蛋白(cAMP response elementbinding protein，CREB)的调控，抑制GTP酶激动蛋白p250GAP(small G proteinactive protein)的翻译，从而调控神经的生长。miR-134特异地表达于海马，与神经元的成熟有关，通过调节其靶基因Lim结构域激酶1(LIM-domain kinase1，Limk1)mRNA，参与树突及突触形成。而miR-124a和miR-9特异地表达于神经祖细胞，通过调控转录激活因子3(Signal Transducer and Activator ofTranscription3，STAT3)的磷酸化水平调节神经元的分化，同时下调抑制元素1-沉默转录因子(Repressor Element-1-silencing transcription factor，REST)的表达水平以诱导非神经基因的下调。Yu等的研究发现，P19小鼠胚胎瘤细胞中miR-124a表达水平与分化神经元神经突起的数量密切相关，这一研究还发现在皮质神经元中，沉默或过表达miR-124a对神经元突起数量亦有明显影响。由此可见，miRNA不仅在神经系统发育、分化中具有重要的作用，而且可能通过关键靶基因的负向调节，参与神经细胞的自我更新或再生。　　 由于海马与听觉系统存在内在的联系，因此我们设想：miRNA可能在内耳神经干细胞向神经元定向分化过程中同样起重要作用。为了证实这一假说，我们利用文献调查和生物信息学预测相结合，选取6个可能与内耳神经干细胞定向分化有关的miRNA为实验内容，通过实时定量PCR(Real-time quantitativePCR，qPCR)检测其在内耳神经干细胞定向分化过程中的表达水平，选择其中表达差异最大的miR-124a为研究对象，观察其在内耳神经干细胞向神经元定向分化过程中的作用。　　 实验一、新生小鼠内耳神经干细胞培养模型的建立及定向诱导分化　　 目的：建立新生小鼠内耳神经干细胞模型，探讨其体外定向诱导分化的可能性。　　 方法：　　 1.分离新生一天小鼠蜗轴，消化、离心、洗涤、吹打、过滤、计数，接种于无血清培养液DMEM/F12(1∶1)培养，内含B27(1∶50)、N2(1：100)、20ng/mlEGF、20ng/ml bFGF，置于5％CO2培养箱(37℃)内培养七天，形成从一个单细胞克隆扩增而成的实心球后，应用免疫荧光技术鉴定神经干细胞的特异性标记物Nestin、Sox2，并且通过掺入BrdU的实验，检测实心球增殖活性。　　 2.收集在增殖培养液中培养七天的实心球，接种于多聚赖氨酸和层粘连蛋白包被的盖玻片上，分化培养液分化培养十四天，采用免疫荧光的方法，检测神经元特异标志TUJ1，观察其分化特性。　　 结果：　　 1.新生小鼠蜗轴分离培养的原代细胞由单细胞状态不断分裂增殖，形成悬浮的实心球。免疫荧光染色显示，悬浮的实心球体多数细胞表达5-溴-2-脱氧尿嘧啶(5-bromo-2-demoxyuridine，BrdU)、细胞巢蛋白(Nestin)以及Sox2，说明悬浮的实心球具有神经干细胞特征。　　 2.诱导分化的神经元生长状态好，突起交织成网，分化十四天达高峰，约40％的细胞可分化为TUJ1表达阳性的神经元。　　 实验二、 miR-124a在内耳神经干细胞向神经元定向分化中的作用　　 目的：利用文献调查和生物信息学预测相结合，选取6个可能与内耳神经干细胞定向分化有关的miRNA为实验内容，检测这六个miRNA在内耳神经干细胞向神经元定向分化过程中的表达水平，选择其中表达差异最大的miR-124a为研究对象，观察其在内耳神经干细胞定向分化过程中的作用。　　 方法：分离培养新生小鼠的内耳神经干细胞七天形成干细胞球后，分别接种于多聚赖氨酸和层粘连蛋白包被的盖玻片上贴壁分化三天和十四天，提取RNA，收集分子量小于200nt的小分子RNA，采用定量PCR方法(TagMan MiRNAAssays)，以snoRNA202做为内对照，检测6个miRNA在内耳神经干细胞定向分化不同时间点的表达水平，选取miR-124a作为研究对象，通过电转染技术在内耳神经干细胞中沉默或过表达miR-124a，观察其对内耳神经干细胞定向分化及分化神经元轴突生长的影响。　　 结果：定量PCR显示miR-124a在内耳神经干细胞向神经元定向分化过程中有显著的差异性表达；电转miR-124a mimics过表达miR-124a后，可促进内耳神经干细胞向神经元方向分化以及分化神经元轴突的生长，电转miR-124ainhibitor沉默miR-124a后对内耳神经干细胞向神经元方向分化以及分化神经元轴突的生长有抑制作用。　　 结论：　　 1.新生小鼠内耳中可分离培养出神经干细胞并可诱导定向分化为神经元。　　 2.miR-124a可以促进内耳神经干细胞的定向分化及分化神经元轴突的生长。