钩藤抗惊厥活性部位的初步研究

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研究背景:  钩藤RamulusUncariaecumUncis为茜草科钩藤属植物钩藤Uncaria rhynchophylla(Miq.)Jacks、大叶钩藤UncariamacrophyllaWal1.、毛钩藤Uncaria hirsuteHavil.、华钩藤 Uncariasinensis(0liv.)Havil.或无柄果钩藤Uncaria sessilifmctusRoxb.的干燥带钩茎枝。秋冬二季采收,去叶,切断,晒干。其性微寒味甘,归肝、心包经,有清热平肝,熄风定惊的作用。现代研究表明钩藤提取物具有抗惊厥的作用,然而其作用的成分未明确。  目的:  本文采用系统溶剂法、柱层析法分离提取钩藤乙醇提取物,通过戊四唑惊厥法筛选出钩藤抗惊厥的活性部位,并对钩藤抗惊厥活性部位进行初步的研究。  方法与结果:  一.钩藤的抗惊厥活性作用药效学研究  1.戊四唑惊厥法的优化  通过不同剂量下皮下注射戊四唑对NIH小鼠致惊厥率,死亡率,惊厥潜伏时间的影响,筛选出具有较高惊厥率,较低死亡率以及较长的惊厥潜伏时间的剂量。结果表明皮下注射87.5mg·kg-1戊四唑会有较好的效果,惊厥潜伏时间在520.50±105.07s,惊厥率为100%,死亡率≤10%。可以作为中药抗惊厥作用的筛选使用。  2.钩藤提取物的抗惊厥研究  通过钩藤水煎物与钩藤乙醇提取物的对比,用戊四唑惊厥法初步筛选出具有较强抗惊厥作用的提取物,即钩藤乙醇提取物。  3.钩藤提取物的系统溶剂法分离  采用系统溶剂分离出钩藤乙醇各萃取部位,并用戊四唑惊厥法研究其抗惊厥作用,发现钩藤提取物乙酸乙酯部位具有抗惊厥作用。  二、钩藤乙酸乙酯部位的研究  对钩藤乙酸乙酯部位进行柱层析的分离纯化,固定相:硅胶,洗脱液:乙酸乙酯:25%氨水=100:5(V/V),通过柱层析法分离纯化,得到富集了钩藤碱和异钩藤碱的流份,戊四唑惊厥法证实该部分具有较强的作用,是为钩藤抗惊厥的活性部位。  三、钩藤抗惊厥活性部位成分的初步研究  1.HPLC法测定钩藤中钩藤碱和异钩藤碱含量  方法:采用RP-HPLC法测定钩藤中钩藤碱和异钩藤碱的含量,钩藤中钩藤碱和异钩藤碱的提取采用甲醇冷浸超声法提取。HPLC色谱柱:色谱柱:Phenomenex C18柱(4.6mm×150 mm,5μm);流动相:甲醇:水=70:30(V/V,含0.01 mmol/L三乙胺,冰醋酸调pH7.0);流速:0.5mL·min-1;检测波长:245nm;柱温:30℃;进样器温度:5℃。  结果表明,钩藤中钩藤碱和异钩藤碱两峰分离度良好,经方法学测定,符合方法学的要求。适用于钩藤药材及钩藤药材制剂的钩藤碱与异钩藤碱含量测定。  2.钩藤抗惊厥活性部位不同时间药效与钩藤碱、异钩藤碱含量关系的研究  通过检测不同时间下钩藤抗惊厥活性部位的钩藤碱和异钩藤碱含量,对比其对戊四唑NIH小鼠急性惊厥的潜伏时间,发现钩藤碱含量和异钩藤碱含量与惊厥潜伏时间呈正相关。表明了钩藤碱和异钩藤碱是钩藤抗惊厥的主要活性成分之一。  结论:  钩藤抗惊厥作用的活性部位是钩藤的乙酸乙酯部位,活性部位中含有的钩藤碱和异钩藤碱是主要抗惊厥的活性成分之一。
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