论文部分内容阅读
目的阿尔茨海默病(AD),又称老年性痴呆,是一种中枢神经系统退行性疾病,该病常见于老年人。异常过度磷酸化的tau蛋白是阿尔茨海默病患者脑中神经元纤维缠结(NFTs)的主要组成成分,并且患者痴呆程度与神经元纤维缠结的数量呈明显的正相关,在神经退行性疾病中tau蛋白的病理性聚集是其主要特征之一。cAMP反应元件结合蛋白(CREB)是一种主要的转录调控因子,在神经元保护转录系统中起到至关重要的作用。根据本课题组之前的研究结果发现,与正常人的大脑相比,AD患者脑中总tau含量是上升的,CREB含量和活性是下降的,又因为CREB是一种重要的转录调控因子并且在AD患者脑中PKA-CREB信号通路有所下调,所以本课题主要旨在分子水平、细胞水平,动物水平来探讨CREB是否会影响tau蛋白的转录以及如何影响tau蛋白的转录。方法(1)用不同浓度的forskolin侧脑室注射两个月龄的ICR小鼠,脑匀浆Western blots和qPCR分析tau蛋白和tau mRNA的变化。(2)取两月龄的ICR小鼠神经元原代细施进行照代培养,罔不周浓度的forskolin处理,之后做Western blots 和 qPCR分析TAU蛋白和tau mRNA的变化；用PCI-neo/CREB转染SH-SY5Y细胞,之后做Western blots和RT-PCR分析tau蛋白和tau mRNA的变化。(3)依据软件分析,把Tau启动子区、点突变和缺失突变构建到含luciferase报告基因载体pGL3-basic中,利用双报告基因检测系统,研究CREB对tau基因的表达调控作用：通过凝胶阻滞实验(Electrophoretic mobility shift assay, EMS A)和染色钵免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)实验,分别住胞外和胞内证实tau肩动了区CRE与CREB之间的特异性结合。结果(1)forskolin侧脑室注射后,tau的蛋白水平和mRNA水平均F降。(2)forskolin处理神经元冗代细胞,tau的蛋白水平和mRNA水平均下降：用PCI-neo/CREB转染SY5Y细胞,tau的蛋白水平和mRNA水平均下降。(3)MatInspector软件分析发现Tau启动子区含三个cAMP反应元件,分别命轵为CRE-1、CRE-2和CRE-3, CREB过表达可明显地抑制tau启动子驱动的萤光素酶的表达：凝胶阻滞实验和染色体免疫共沉淀证明CREB可以特异性地结合于Tau启动子区的CRE1和CRE3元件;tau启动子区的各敲击除突变体和点突变表明在CREB抑制tau蛋白基因的转录中CRE1起到主要作用。结论(1)CREB主要结合在tau promotor区的CRE1和CRE3元件,而不是CRE2元件。(2)在CREB抑制tau蛋白基因的转录中CRE1起到主要作用。(3) CREB可通过PKA信号通路被活化进而从转录水平来抑制Tau蛋白的表达。