研究背景：随着新的分子靶向药的发现和造血干细胞移植的发展,髓系白血病的治疗有了很大进展,但髓外浸润依然是治疗中最重要的难题之一。初诊时伴髓外浸润的病人往往化疗效果欠佳且易复发,髓外白血病亦常常成为造血干细胞移植后复发的根源；而且目前尚无常规手段对白血病髓外浸润进行全面监测,病人往往出现自身可觉察到的症状时才被发现,使得治疗被延误。因此,对髓系白血病髓外浸润的相关机制进行深入研究,寻找相关靶向分子,对髓外白血病的早期诊断和治疗具有重大意义。细胞运动的接触性抑制(contact inhibition of locomotion, CIL)现象,是指生理或病理情况下,细胞在运动迁移中与其它的细胞发生接触后,改变其运动方向的一种现象。研究提示恶性肿瘤细胞的侵袭行为与CIL异常有关。CIL的过程可能受到细胞表面受体分子Eph的调节。Eph属于酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinase, RTK)受体家族,Eph与其位于不同细胞表面的配体ephrin结合后,两者可同时发生酪氨酸磷酸化,从而介导双向信号传递,调节细胞形态、粘附和运动等。其异常表达与肿瘤发生、耐药、转移及浸润相关,在实体瘤如乳腺癌、胃癌、前列腺癌报道较多,在急性白血病中报道尚不多见。Eph受体激活后可促进与邻近细胞间CIL作用,导致细胞与细胞排斥、去粘附,在组织边界形成,在神经轴突的正确导向中发挥重要作用,从而调节了肿瘤细胞的侵袭性。我们在前期工作中利用蛋白组学技术发现了小G蛋白在慢性髓系白血病中发挥着重要作用,发现酪氨酸激酶受体EphB4通过调控小G蛋白参与慢性髓系白血病对伊马替尼耐药的机制。因而我们着力于研究酪氨酸激酶受体家族Eph受体及其配体Ephrin,我们在预实验中对原代髓系白血病细胞和髓系白血病细胞株23个Eph和Ephrin酪氨酸激酶受体家族成员的mRNA水平进行了广泛的筛查,发现Eph、Ephrin异常表达与髓系白血病侵袭性改变有关。国外部分研究提示细胞接触抑制(CIL)失调是调节肿瘤细胞侵袭性改变的重要行为,且可能受到Eph受体的调控。但CIL受何种机制调节,Eph在髓系白血病的侵袭过程中如何发挥作用尚不明确。这正是我们研究的目的所在。目的：研究Eph/Ephrin的活化介导髓系白血病侵袭性的内在机理,并阐明Eph/Ephrin如何调控CIL从而介导髓系白血病侵袭性的改变,为髓系白血病侵袭性的机制研究提供新的思路,为髓系白血病髓外浸润的治疗提供新的靶点。方法：1.利用QT-PCR和Western-blot对髓系白血病细胞株K562和HUVEC22个eph和ephrin酪氨酸激酶受体家族成员的mRNA水平进行检测；然后检测急性髓系白血病细胞株(HL-60, U937等)和13例急性髓系白血病患者(其中包括5例伴髓外侵犯患者)与10例正常供者的EphA5及EphB4(在髓系白血病中表达最高)mRNA及蛋白表达水平；2.利用RNA干扰技术构建稳定低表达EphB4的K562细胞株(K562-EphB4-sh)和稳定低表达EphA5的K562细胞株(K562-EphA5-sh);3.利用Transwell侵袭及迁移实验检测不同急性髓系白血病细胞株K562、U937、HL60和K562-EphB4-sh、K562-EphA5-sh的侵袭力及迁移力；利用Confocal Time-lapse maging结合图像分析软件Volocity software定量分析不同急性髓系白血病细胞株K562-K562、HUVEC-HUVEC、K562-HUVEC接触抑制运动情况和干扰EphB4、EphA5后CIL改变情况；4.利用Transwell侵袭及迁移实验检测K562和HUVEC共培养后侵袭力的改变；5. Ephrin配体刺激实验：分别予ephrin-A1、ephrin-B2、Fc control(对照)于不同时间点刺激K562细胞后,利用Transwell侵袭及迁移实验检测K562侵袭力及迁移力的改变,同时利用Western-blot检测其下游信号通路RhoA/MMps通路的变化；利用Confocal Time-lapse maging结合图像分析软件Volocity software分析CIL改变情况,并利用Western-blot分析相应改变所伴随Rac1/Cdc42的变化；利用免疫荧光分析Ephrin与Eph结合定位情况；利用电镜扫描分析细胞形态改变。6.统计学方法：采用SPSS17.0软件处理数据,数据以均数±标准差(x±s)或中位数(范围)表示。两组间比较时,采用两独立样本t检验。多组间均数比较时,若方差齐则采用单因素方差分析；若方差不齐采用近似Welch法。组内多重比较若方差齐采用LSD法,若方差不齐则用Dunnett’s T3法。若资料为偏态分布,则用非参数方法比较两者差异。P<0.05认为差异有统计学意义。结果：1.Eph家族在急性髓系白血病细胞株及原代髓系白血病细胞中的表达：1) mRNA水平：K562细胞中的EphA5、EphB4表达水平显著高于HUVEC (P=0.007、P=0.048); HUVEC中EfhA1、EfhA5、EfnB2表达水平显著高于K562 (P<0.001、P=0.022、P=0.001)。相对于正常人,K562、HL60、U937、急性髓系白血病伴髓外浸润者细胞均高表达EphB4 (P<0.001、PO.001;P<0.05、P<0.05; P<0.001、P<0.001)。2)蛋白水平(EphB4、EphA5在急性髓系白血病株及原代髓系白血病细胞中的蛋白水平表达)： 相比正常人骨髓细胞,急性髓系白血病细胞株(K562、U937、HL60、KG1a、kasumi、HLA)均高表达EphB4、EphA5、 EfnA1、EphBl;相对于急性髓系白血病不伴髓外浸润者,急性髓系白血病伴髓外浸润者的EphB4、EphA5有升高趋势。3)急性髓系白血病患者中EphB4、EphA5 mRNA表达水平：AML伴髓外浸润者、AML不伴髓外浸润者和正常对照组间EphB4和EphA5 mRNA水平存在显著性差异(F=294.825, P<0.001; F=40.411, P<0.001)。AML伴髓外浸润者EphB4和EphA5水平均显著高于正常对照组(P<0.001；P<0.001),且AML伴髓外浸润者EphB4和EphA5水平均显著高于AML不伴髓外浸润者(P<0.001；P=0.001)。2.稳定低表达EphB4的K562细胞株K562-EphB4-sh和稳定低表达EphA5的K562细胞株K562-EphA5-sh的构建：测序后证实目的片段与相应质粒均连接成功,K562细胞经慢病毒感染及流式细胞仪分选后测定RFP阳性率和GFP阳性率分别为80%和90%,QT-PCR和Western-blot分别验证EphB4和EphA5在K562细胞中稳定低表达,稳定低表达EphB4的K562-EphB4-sh和稳定低表达EphA5的K562-EphA5-sh细胞株建立成功。3. EphB4/EprinB2介导髓系白血病细胞侵袭力及迁移力的改变：1) K562、U937、H1-60细胞迁移力及侵袭力比较：Transwell迁移实验提示迁移到下室的细胞数在三组间存在显著性差异(F=310.011,P<0.001)。多重比较LSD法显示K562和U937迁移到下室的细胞数显著高于HL60 (P<0.001、P<0.001);同时K562和U937迁移到下室的细胞数也存在统计学差异,前者显著高于后者(P<0.001)。侵袭实验显示穿过基质胶的细胞数在三组间存在显著性差异(F=295.360,P<0.001)。多重比较LSD法显示K562和U937穿过基质胶的细胞数显著高于HL60 (P<.001、P<0.001),同时K562和U937穿过基质胶的细胞数也存在统计学差异,前者显著高于后者(P=0.002)。2) K562、K562-EphB4-sh、K562-EphA5-sh细胞迁移力和侵袭力的比较：以K562细胞迁移到下室的细胞数为参照,发现：迁移到下室的细胞比值在三组间存在显著性差异(F=39.334,P=0.000)。相对于K562细胞,K562-EphB4-sh迁移到下室的细胞比值显著降低,降低了0.500倍(P=0.000),而K562-EphA5-sh迁移到下室的细胞比值无统计学差异(P=0.808)。同样,以K562细胞侵袭到基质胶的细胞数为参照,发现：穿过基质胶的细胞比值在三组间存在显著性差异(F=16.840,P=0.003)。相对于K562细胞,K562-EphB4-sh穿过基质胶的细胞比值显著降低,降低了0.350倍(P=0.002),而K562-EphA5-sh穿过基质胶的细胞比值无统计学差异(P=0.815)。3)K562与HUVEC共培养后侵袭力和迁移力的改变：相对共培养前,K562与HUVE共培养后迁移到下室的细胞比例显著增加(t=-3.130,P=0.035); K562与HUVE共培养后侵袭到下室的细胞比例显著增加(t==-2.988,P=0.040)。4)配体刺激实验：以Fc control处理组迁移到下室的细胞数为参照,采用单因素方差分析EphrinAl-Fc处理组、EphrinB2-Fc处理组、Fc对照组迁移到下室的细胞比值(folds),发现迁移到下室的细胞比值在三组间存在显著性差异(F=7.181,P=0.026)。多重比较LSD法显示相对于Fc control组,EphrinB2-Fc处理组迁移到下室的细胞数比值显著增加到1.8500倍(P=0.033),而EphrinA1-Fc处理组迁移到下室的细胞数比值无统计学差异(P=0.411)。同样,以Fc control处理组侵袭到基质胶的细胞数为参照,采用单因素方差分析三组穿过基质胶的细胞数比值(folds),穿过基质胶的细胞数比值在三组间存在显著性差异(F=13.336,P=0.006)。多重比较LSD法显示相对于Fc control组,EphrinB2-Fc处理组侵袭到基质胶的细胞数比值显著增加到1.460倍(P=0.025),而EphrinA1-Fc处理组侵袭到基质胶的细胞数比值无统计学差异(P=0.072)。我们采用transwell迁移和侵袭实验分别比较EphrinA1-Fc、EphrinB2-Fc及Fc control处理组对K562-EphB4-sh细胞迁移力及侵袭力的差异,分别以Fc control处理组穿过下室和侵袭到基质胶的细胞数为参照,采用单因素方差分析三组细胞数比值(folds),发现穿过下室和基质胶的细胞比值在三组间均不存在显著性差异(F=5.030, P=0.052; F’=2.3369, P=0.259)。我们采用transwell迁移和侵袭实验分别比较EphrinAl-Fc、EphrinB2-Fc及Fc control处理组对K562-EphA5-sh细胞迁移力及侵袭力的差异,以Fc control处理组穿过下室和侵袭到基质胶的细胞数为参照,采用单因素方差分析三组的细胞数比值(folds),发现穿过下室和基质胶的细胞比值在三组间均不存在显著性差异(F=2.930, P=5.141; F=13.336, P=0.050)。5) Ephrin-Fc刺激后,加入带荧光的抗Fc后的免疫荧光显示：Ephrin直接与Eph结合,导致K562细胞迁移力及侵袭力的改变。Ephrin B2-Fc刺激后,不同时间点检测相关信号通路蛋白水平：RhoA、MMp2、MMp9,发现Ephrin B2-Fc组蛋白表达有增加趋势,45 min刺激后其表达水平显著增加,同时磷酸化EphB4蛋白也随之升高。4. EphA5/EprinAl介导髓系白血病细胞接触抑制的改变1)定量分析K562-K562、HUVEC-HUVEC、K562-HUVEC接触抑制运动情况：采用Time-lapse maging And confocal microscopy结合图像分析软件Volocity software,用Cx定量分析细胞间同型及异型CIL,以Mann-Whitney方法分别分析定量分析K562-K562、HUVEC-HUVEC、 K562-HUVEC三组在自由运动和细胞碰撞下Cx值的改变情况,结果发现K562-K562和HUVEC-HUVEC的Cx值在两种情况下均存在显著差异(P=0.002,P<0.001),而K562-HUVEC组无统计学差异(P=0.443)。即K562-K562、HUVEC-HUVEC间存在同型CIL, K562-HUVEC间存在异型CIL。2)比较K562-HUVEC的接触抑制情况：以Mann-Whitney方法分别分析K562、K562-EphB4-sh和K562-EphA5-sh分别与HUVEC共培养时CIL情况,即Cx值的改变情况,结果发现K562-EphA5-sh组的Cx F和CxC值存在显著差异(P<0.001),而K562和K562-EphB4-sh两组的Cx F和Cx C值均无统计学差异(P=0.775,P=0.917)。即干扰EphA5后,K562与HUVEC间的异型CIL受损,而干扰EphB4后,K562与HUVEC间的CIL无改变。3)配体刺激实验：以Mann-Whitney方法分别分析EphrinAl-Fc 、 EphrinB2-Fc、ephrin-Fc(对照)刺激后,K562与HUVEC共培养时CIL改变情况,即Cx值的改变情况,结果发现, EphrinB2-Fc和ephrin-Fc(对照组)刺激后K562细胞CIL无显著改变(P=0.892,P=0.341),而EphrinA1-Fc刺激后K562细胞CIL发生显著改变(P=0.005)。以Mann-Whitney方法分别分析EphrinA1-Fc、EphrinB2-Fc、Fc control (对照)刺激后,K562-EphB4-sh与HUVEC共培养时CIL改变情况,即Cx值的改变情况,结果发现,三组刺激后K562-EphA-sh细胞CIL均无显著改变(P=0.892, P=0.341)。 K562-EphA5-sh与HUVEC共培养时CIL改变情况,即Cx值的改变情况,结果发现,三组刺激后K562-EphA-sh细胞CIL均无显著改变(P=0.005,P=0.341)。4) EphrinAl-Fc刺激后,不同时间点检测相关信号通路蛋白水平：Rac1、Cdc42、磷酸化EphA5,发现Ephrin A1-Fc组蛋白表达有增加趋势,45mmin刺激后其表达水平显著增加,同时磷酸化EphA5也随之升高。电镜扫描发现EphrinA1-Fc刺激组,K562细胞表面有大量伪足形成,而EphrinB2-Fc组和Fc control组均未观察到同样现象。结论：1.EphB4和EphA5异常表达与髓系白血病的侵袭性相关,EphB4和EphA5表达越高者,髓系白血病细胞侵袭性越高；EphB4干扰后,髓系白血病细胞侵袭性随之降低；2. K562-K562间、HUVEC-HUVEC间存在同型CIL, K562-HUVEC存在异型CIL; EphB4及EphA5干扰后,K562-HUVEC间异型CIL减弱；3. Eph/Ephrin的信号的活化通过两方面调控髓系白血病细胞侵袭性：EphB4/EprinB2的活化导致了其下游信号通路RhoA/MMps的活化,从而导致基质降解,促进了髓系白血病细胞的侵袭性；EphA5/EprinAl的活化可能致Rac1/Cdc42的活化从而使得髓系白血病细胞间同型CIL增强,从另一方面促进了髓系白血病细胞的侵袭性。