癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)是一种高度糖基化、分子量为180 kDa的肿瘤相关抗原,在90%以上的结直肠癌以及许多肿瘤中高表达,在正常成人结肠上皮及其它内胚层来源的组织中呈低表达。有研究表明,联合应用CEA蛋白和佐剂、CEA多肽、抗CEA独特性抗体以及以CEA为基础的重组痘病毒疫苗均可诱导出CEA特异性CTLs。然而,作为自身蛋白及其所具有的免疫耐受性,CEA的免疫原性比较低,使得HLA/肽复合物与CTLs的亲和性比较低,找到高亲和力的CTLs就成为当今肿瘤免疫研究的热点之一。因此,我们选择CEA作为免疫治疗的“靶点”,考虑到HLA-A*0201等位基因在约50%的人群中表达及其与HLA-A*0201位点结合的CEA分子的多肽CAP-1被确认,故选择HLA-A*0201+ CEA+的结直肠癌患者作为研究对象。主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)编码的Ⅰ类分子分布在所有有核细胞表面,将细胞内经过加工的肽段提呈到细胞表面,激活抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs),在抗感染、抗肿瘤和自身免疫反应中起着重要作用。定量分析抗原特异性CTLs能为研究特异性免疫应答的发生、发展过程提供重要的信息。传统的定量CTLs的方法如51Cr释放实验、有限稀释法(limited dilution assays,LDA)等需要体外培养淋巴细胞,费时费力,敏感性低。可溶性HLA/肽四聚体具有敏感、特异和高效等特点,不仅能够直接计数抗原特异性CTLs,还能对其进行表型和功能分析,大大推进了抗原特异性CTLs的研究。本课题应用基因工程技术制备可溶性HLA-A*0201/FLUmp四聚体和HLA-A*0201/CAP-1四聚体。利用可溶性HLA-A*0201/FLUmp四聚体,进行生物学活性实验和检测抗原特异性CTLs条件的优化,寻求可溶性HLA-A*0201/肽四聚体检测的标记顺序和最适浓度、温度,进而运用可溶性HLA-A*0201/ CAP-1四聚体检测结直肠癌患者体内CEA抗原特异性CTLs的频率,为进一步分析CEA抗原特异性CTLs的表型和功能提供重要的研究工具,为研究CTLs在结直肠癌发生、转归中的确切作用机制奠定物质基础。本研究分为三部分内容。第一部分可溶性HLA-A*0201/CAP-1四聚体的构建目的:可溶性HLA/肽四聚体能够直接计数抗原特异性CTLs,还能对其进行表型和功能方面的分析,大大推进了抗原特异性CTLs的研究。为了检测CEA特异性CTLs,我们制备了可溶性HLA-A*0201/FLUmp四聚体和HLA-A*0201/CAP-1四聚体。方法:首先,应用基因工程技术表达和纯化可溶性HLA-A*0201重链和β2m轻链。利用RT-PCR技术分别从THP1细胞和U937细胞中扩增出HLA-A*0201细胞膜外部分和去除信号肽部分的β2m基因;以RT-PCR产物为模板,利用PCR方法将含有可供生物素化识别位点的15个氨基酸残基序列(substrate peptide for BirA-dependent biotinylation, BSP)和甘氨酸-丝氨酸接头的序列拼接在HLA-A*0201胞外区的COOH端。分别将HLA-A*0201-BSP和β2m基因克隆入pQE31表达载体进行原核表达并纯化蛋白。接着,将纯化好的HLA-A*0201-BSP融合蛋白、β2m以及特异性肽(CAP-1/ FLUmp)在氧化-还原谷胱甘肽系统中复性,形成HLA-A*0201/肽复合物单体。用HLA-I类分子构象特异性的W6/32单抗为一抗,间接ELISA法检测复性前后HLA-A*0201/抗原肽单体。然后,将复性后单体经Sephacryl-300柱层析纯化,利用分子筛原理收集HLA-A*0201/肽复合物单体所在峰。以BirA酶作用于融合在HLA-A*0201蛋白C端BSP中的赖氨酸残基,使HLA-A*0201/肽复合物单体生物素化,再次经Sephacryl-300柱层析纯化。生物素化的HLA-A*0201/肽复合物单体与藻红蛋白标记的链亲和素按4∶1的比例混合形成四聚体。结果:酶切鉴定和测序结果表明获得pQE31-HLA-A*0201-BSP重链表达载体和pQE31-β2m轻链表达载体。诱导表达产物经SDS-PAGE电泳分析,分别在大约34 kDa和12 kDa处有一新生带,与预期结果相符。可溶性分析显示HLA-A*0201-BSP和β2m主要以包涵体的形式存在。蛋白表达的最佳诱导条件为1 mmol/L IPTG于37℃诱导过夜。用洗涤包涵体的方法可获得大量蛋白,纯度达95%左右。Western blot鉴定HLA-A*0201-BSP的免疫学性质,杂交结果显示诱导菌体泳道中对应34 kDa分子量处有一条较强的杂交带,而未诱导菌体泳道没有此杂交带。将纯化好的HLA-A*0201-BSP融合蛋白、β2m以及特异性肽(CAP-1或FLUmp)在氧化-还原谷胱甘肽系统中复性,形成HLA-A*0201/肽复合物单体。W6/32单抗能特异性结合复性后的HLA-A*0201/CAP-1单体,并存在量效关系。HLA-A*0201-肽复合物单体经Sephacryl-300柱层析纯化后,用BirA酶使HLA-A*0201/肽复合物单体生物素化,并再次经Sephacryl-300柱层析纯化。生物素化的HLA-A*0201/肽复合物单体与藻红蛋白标记的链亲和素按4∶1的比例混合形成四聚体。结论:获得pQE31-HLA-A*0201-BSP重链表达载体和pQE31-β2m轻链表达载体。经洗涤包涵体获得大量高纯度重、轻链蛋白。稀释法复性获得HLA-A*0201/FLUmp单体和HLA-A*0201/CAP-1单体并获得相应可溶性四聚体。第二部分可溶性HLA-A*0201/肽四聚体的生物学活性验证以及抗原特异性CTLs检测条件的优化目的:验证可溶性HLA-A*0201/肽四聚体的生物学活性以及优化检测抗原特异性CTLs的条件。方法:用1μg HLA-A*0201/FLUmp四聚体和2μl anti-CD8-FITC单抗,标记HLA-A*0201+健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC),比较标记物加入顺序的不同对特异性CTLs检测的影响,选择标记四聚体的最佳浓度和温度。在此基础上,分离HLA-A*0201+健康志愿者PBMC,与1μg HLA-A*0201/FLUmp四聚体25℃避光孵育1 h后,加入2μl anti-CD8-FITC单抗室温避光孵育1 h,经PBS洗涤、1%多聚甲醛固定,流式细胞仪检测流感病毒特异性CTLs的频率。为验证四聚体的稳定性,7 d后在相同的条件下重复本实验,共重复三次。结果:先标记anti-CD8-FITC单抗可阻断四聚体与抗原特异性CTLs的结合,而按四聚体、anti-CD8-FITC单抗的标记顺序,则不会影响四聚体与抗原特异性CTLs的结合。浓度为1μg的四聚体与特异性CTLs的亲和性最高,所检测到的双阳性细胞占总CD8+细胞数的3.8%。25℃标记时检测到的抗原特异性CTLs的频率略低,占总CD8+细胞数的0.9%,但其特异性较好。按照上述优化条件,流式细胞仪检测HLA-A*0201+健康志愿者外周血PBMC中流感病毒FLUmp特异性CTLs的频率。三次检测抗原特异性CTLs的频率分别占总CD8+细胞数的1.3%、1.6%和1.2%,说明所制备的可溶性四聚体具有比较稳定的生物学功能。结论:可溶性四聚体检测抗原特异性CTLs条件的优化,为抗原特异性CTLs的后续研究打下了坚实的基础。第三部分HLA-A*0201/CAP-1四聚体在结直肠癌研究中的初步应用目的:应用HLA-A*0201/CAP-1四聚体,对HLA-A*0201+正常人外周血淋巴细胞和HLA-A*0201+CEA+结直肠癌患者的外周血及癌旁肠系膜引流淋巴结的淋巴细胞进行染色,流式细胞仪分析HLA-A*0201限制的、CEA特异的CTLs的数量。方法:分离健康人(18例)PBMC和结直肠癌(23例)患者PBMC以及癌旁肠系膜引流淋巴结的淋巴细胞,以流式细胞仪检测PBMC表达HLA-A*0201的情况,用HLA-A*0201/CAP-1或HLA-A*0201/FLUmp四聚体检测CAP-1和FLUmp特异性CTLs的频率。结果:在25例HLA-A*0201+个体中,结直肠癌组和正常组外周血单个核细胞中HLA-A*0201/FLU四聚体+CD8+细胞的频率分别为0.671±0.421%和0.564±0.408%,两组之间无显著差异(P=0.525)。结直肠癌组和正常组外周血单个核细胞中HLA-A*0201/CAP-1四聚体+CD8+细胞的频率分别为2.409±2.385%和0.020±0.021%,两组之间有显著差异(P=0.008)。HLA-A*0201+结直肠癌患者外周血和无肿瘤细胞转移的淋巴结内淋巴细胞中HLA-A*0201/CAP-1四聚体+CD8+细胞频率分别为2.409±2.385%和2.685±2.332%,两组之间无显著差异(P>0.05)。结论:HLA-A*0201+结直肠癌患者PBMC和无肿瘤细胞转移的淋巴结中HLA-A*0201/CAP-1四聚体+CD8+细胞的频率升高,说明CEA特异性CTLs在结直肠癌患者的免疫监视功能中具有重要的作用。对存在针对肿瘤抗原的特异性CTLs却无法阻止肿瘤形成的具体机制需要更加深入的研究。