研究背景鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌(简称鼠疫菌)引起的一种自然疫源性疾病。在自然界鼠疫菌主要在啮齿动物间传播,也可通过蚤叮咬或者其它途传染给人,引发腺鼠疫、肺鼠疫和败血症鼠疫。在机体感染早期,鼠疫菌能在巨噬细胞内存活并繁殖,是鼠疫菌得以最终致病的关键阶段。鼠疫菌在媒介(跳蚤)和宿主(哺乳动物)间循环的过程中,不可避免地遭遇多个信号(温度、离子浓度、渗透压、pH、氧、自由基、过氧化物、碳源、氮源等)的协同刺激,一旦进入宿主体内,病原菌能够有效感应这些信号并迅速做出反应,通过调动多种调控机制适应环境压力。细菌中除了蛋白质类的调控因子之外,还存在着一些发挥调控作用的非编码RNA(small non-coding regulatory RNA, sNRA),也称为小RNA。小RNA广泛存在原核生物,通常位于基因间区(IGR),长度为50-500bp左右,转录后一般不翻译为蛋白质,有特殊的茎环结构,可通过碱基反向互补调控靶mRNA翻译和稳定性。小RNA作为一种有效的调节分子,在对原核生物生理和毒力功能的调节中起到十分重要作用。如可直接感应温度、pH值、氧气浓度和营养条件等环境信号,参与细菌铁代谢、压力反应、碳代谢、糖利用、外膜平衡、密度感应、毒力等生理功能的调控。细菌小RNA对靶mRNA调控大多需要Hfq(host factorfor RNA phage QP replicase)伴侣蛋白的参与。Hfq是一种RNA结合蛋白,存在于革兰氏阳性和革兰氏阴性菌中,胞内形成六聚体结构,是一种高度保守的耐热蛋白。在调节过程中,Hfq与小RNA分子结合,促进RNA分子间配对和稳定小RNA,被认为是细菌基因转录后的关键调控因子。对大多数生物来说,铁是一把双刃剑。正因为如此,细菌进化过程中已经形成一套铁稳态调节系统来维持合适的细胞内铁水平,既要满足正常的生理需要,又能防止其毒性作用。细菌中,Fur(ferric uptake regulator)蛋白是一种关键的转录抑制蛋白,控制铁代谢和Fe2+作为辅助因子的利用。低铁时,Fur蛋白失活,铁摄取相关基因表达。相反,铁离子浓度增加时,Fur蛋白激活,铁摄入基因表达抑制,含铁蛋白和铁储存蛋白基因表达激活。在肠杆菌科中,这种激活多需要两步连续的抑制,即Fur蛋白抑制一个90nt的调节小RNA—RyhB的转录,继而在Hfq的辅助下,RyhB与含铁蛋白编码基因mRNA互补配对,抑制后者的翻译和促进rnRNA的降解。其中,Hfq蛋白作为伴侣蛋白,可增强RyhB稳定性,在转录后水平调控靶mRNA。因此,RyhB能通过抑制铁利用相关蛋白的表达,增加细胞内铁离子浓度,确保铁必需蛋白的铁利用,维持细胞铁稳态。与蛋白类调节子类似,同一个小RNA可调控多个靶分子。RyhB是目前已知调控靶mRNA数目最多的小RNA。目前已经鉴定大肠埃希氏菌RyhB直接调控的转录本共22个,共涉及64个基因,涉及三羧酸循环(TCA)、糖酵解、氧化应激、铁-硫簇形成以及需氧和厌氧呼吸等,除此以外,RyhB还能负反馈调节Fur基因的表达。RyhB除了与铁代谢功能相关外,在霍乱弧菌和痢疾志贺氏菌中,还发现RyhB的转录还影响到细菌动力、化学趋化、生物膜、酸耐受、氧化还原甚至毒力基因的表达等。铁代谢在鼠疫菌致病过程中至关重要,而RyhB义是其中关键的调节小RNA。我们对肠杆菌科基因组序列进行了分析,结果发现：大多数基因组内只存在一个RyhB,而只有耶尔森氏菌和沙门氏菌基因组内存在两个RyhB同源拷贝,其中一个拷贝可能是进化分支过程中获得的。鼠疫耶尔森氏菌两个RyhB——RyhB1和RyhB2都位于染色体上,且相距较远。同源性比对分析发现：鼠疫菌RyhB二者序列同源性达到69%,与大肠埃希氏菌和沙门氏菌RyhB相比,同源性在61%到72%之间。在细菌RyhB调控方面的认识已经较为深入。然而,多数细菌基因组内仅存在一个RyhB,在沙门氏菌和耶尔森氏菌进化获得的另一个拷贝,究竟在细菌生理乃至致病过程中发挥怎样的作用?二者调控与生理功能的比较研究将有助于解决以下间题：二者是否功能冗余,可否相互叠加?它们各自调控的靶分子有哪些?存在哪些共同或差异的转录调节特征?因此,本课题旨在比较分析鼠疫菌两个RyhB的转录调节特征,寻找RyhB进化过程中可能获得的新的调节规律,并将靶分子调节特征与生理乃至致病表型联系起来。方法：基于λ-Red同源重组原理,本研究利用两步PCR法构建RyhB1和RyhB2单、双基因缺失突变株,在双缺失突变株基础上,构建RyhB1和RyhB2的诱导表达株。提取对数中期低铁条件下的鼠疫菌野生株菌体总RNA,设计分别针对RyhB1和RyhB2特异引物,采用引物延伸实验寻找RyhB1和RyhB2各自转录起始位点,并结合生物信息学预测分析鼠疫菌RyhB1和RyhB2序列特征。提取鼠疫菌野生株、△ryhB1、△ryhB2、△ryhB1:△ryhB2、Afur和△hfq突变株不同条件下(高铁、低铁不同时间点)的菌体总RNA,利用Northern Blotting技术验证上述条件下RyhB1和RyhB2的转录情况。另外,低铁条件下加入利福平0、2、4、8、16、32min后,测定野生株和△hfq突变株RyhB1和RyhB2转录水平,计算各白半衰期。鼠疫菌RyhB1和RyhB2诱导表达株在阿拉伯糖诱导后,提取对照组(空载体)和RyhB1和RyhB2诱导表达株总RNA和总蛋白,用于芯片转录组(转录水平)和2D差异蛋白谱(翻译水平)分析,寻找差异表达的基因,获得转录水平的RyhB1和RyhB2调控元,并对基因功能进行分类。在绘制生长曲线和观察菌落形态基础上,结合RyhB调控元分析结果和鼠疫菌传播致病特点,确定表型研究的主要内容。利用体外生长和存活实验,比较鼠疫菌野生株和z△ryhB突变株对短期刺激(如氧化胁迫)和长期刺激(如高盐、低铁和营养缺乏)的敏感性或耐受性。鼠疫菌野生株和ryhB突变株以皮下感染BALB/C小鼠,最终计算半数致死剂量(LD50)；鼠疫菌野生株和突变株等量混合后,大剂量滴鼻感染小鼠,分析动物体内脏器的细菌分布情况,并计算竞争指数(competitive index, CDI)。统计分析采用SPSS13.0软件。计量资料采用均数±标准差(mean±SD)表示。两组的均数比较采用两独立样本t检验,多组均数的比较先进行方差齐性检验,若方差齐,则采用单因素方差分析,多重比较采用LSD法；若方差不齐采用近似F检验的Welch方法,多重比较采用Dunnett’s T3检验。三种不同株(WT、△hfq、Afur)在高低铁环境下对RyhB1和RyhB2的表达量的影响采用三因素的析因设计方法。DIP诱导不同时间对RyhB表达的影响,使用单组重复测量方差分析,若不满足球形检验则使用Greenhouse-Geisser ε校正系数的结果,P<0.05认为差异具有统计学意义。结果：成功构建△ryhB1、△ryhB2、△ryhB1:△ryhB2、△ryhB1:△ryhB2△fur三敲除株及pBAD-RyhB1, pBAD-RyhB2过表达株。通过生物信息学分析,鼠疫菌有两个拷贝RyhB1和RyhB2,同源性高(一致序列为69%),启动子区存在Fur结合位点、-10区,-35区、核心保守序列(31nt)和非依赖ρ的转录终止子序列。引物延伸试验能确定RyhB1和RyhB2转录起始位点与生物学预测结果一致。Northern Blotting检测不同菌株低铁和高铁条件’下RyhB1和RyhB2的转录水平结果显示：RyhB1和RyhB2均在低铁条件下高表达,当fur基因缺失后,RyhB水平上调,提示鼠疫菌RyhB1和RyhB2均受铁和Fur蛋白负调节,这一点与大肠埃希氏菌RyhB调节是一致的。在检测低铁不同时间野生株和hfq缺失突变株RyhB转录水平时,我们发现：在野生株中,RyhB1和RyhB2在低铁30min时仍然很稳定；而当hfq缺失时,RyhB2仍能保持稳定,而RyhB1不稳定。半衰期结果显示：在hfq缺失时,RyhB2的半衰期远高于RyhB1。这一结果提示：RyhB1的稳定性依赖于Hfq,而RyhB2不依赖。在调控元分析方面,提取诱导条件下鼠疫菌RyhB1和RyhB2表达株的总RNA,用于芯片转录组分析,初步结果提示：RyhB1和RyhB2存在共同的和差异的调控元。两者共同调控的转录本有47个,RyhB1独自调控的转录本有31个,RyhB2独自调控的转录本有58个,对上述136个基因进行了功能分类,转录调控的基因按功能分为12类。通过蛋白质组学技术获得18个差异蛋白两个RyhB既有独自的靶标,又有共同的靶标,生物芯片和质谱分析RyhB2均调控相同靶基因如hmsF,两者结果一致。检测肺鼠疫模型中小鼠肺、脾脏器中鼠疫菌RyhB1和RyhB2的转录水平,结果发现：鼠疫菌RyhB1和RyhB2在小鼠肺内高表达,提示RyhB在鼠疫菌生理、体内适应和致病过程中可能发挥重要作用。然而,通过表型试验和动物试验来研究RyhB1和RyhB2对生理和毒力的影响。野生株和RyhB1和IRyhB2缺失突变株在营养丰富或缺乏、低铁和高盐等条件下不会影响细菌的生长末见明显的生长差异。当用220mmol/L H202刺激野生株和ryhB单双敲除株,发现△ryhB1:△ryhB2生存率较野生株降低。将野生株与ryhB双敲除株等量混合感染小鼠后,都能从肺和脾中分离到两种菌株。在肺中的CI值分别为：48h为3.75,72h为1.14；在脾中的CI值：48h为0.7,72h为1.7。上述结果说明当RyhB缺失后,并不影响鼠疫菌在体内生长和繁殖过程,鼠疫菌在小鼠体内生存能力无明显变化。在小鼠生存试验中,鼠疫菌ryhB突变株跟野生株相似,均在4-8d内都死亡,说明RyhB可能不直接参与小鼠致病。结论：1.在本实验室搭建了成熟的两步法小RNA缺失、非放射性标记Northern blot检测及诱导表达的三个技术平台,为小RNA基因功能研究奠定了基础。2.鼠疫菌RyhB1和RyhB2受铁离子和Fur蛋白负调控。3. RyhB1稳定性依赖Hfq,而RyhB2不依赖。这是同类小RNA存在稳定性差异的最新证据,为探讨sRNA降解机制提供了新的思路。4.鼠疫菌RyhB1和RyhB2调控元分析显示二者有相同也有差异靶标,提示二者除了共同在铁代谢过程中发挥作用外,还可能在其它代谢途径中发挥各自不同的作用。5.本研究结果显示缺失ryhB后,鼠疫菌耐受H202能力明显下降,提示RyhB可能在抗氧化过程中发挥作用。而RyhB2过表达时,HmsF的上调也提示RyhB2很可能与生物膜形成相关。