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ICOS及其配体GL50是最近发现的CD28／B7家族的一对新成员。ICOS主要表达在活化的T细胞上，而GL50可表达在活化的B细胞、巨噬细胞或诱导表达于成纤维细胞等多种细胞表面。业已的研究表明，GL50-ICOS在机体的炎症反应、B细胞应答和移植免疫中发挥了重要作用，展示了其潜在的应用前景。然而，GL50-ICOS在机体免疫调节中的分子机制尚待进一步阐明，更重要的是，目前对GL50-ICOS的功能研究主要集中在小鼠。鉴此，我们在国内率先采用基因工程技术克隆了全长的人ICOS和GL50基因和胞外段cDNA，构建了ICOS／GL50转基因细胞，并在大肠杆菌中成功表达了具有生物学活性的ICOS／GL50可溶性重组蛋白，对其生物学活性作了初步探讨。由于共刺激分子的细胞表达特性与其功能具有密切关系，继而我们系统地分析了ICOS／GL50的细胞表达谱，并初步探讨这对共刺激分子在甲状腺功能亢进免疫病理中的作用及其机制。上述研究结果，有一些为首次报道。 一、ICOS／GL50的基因克隆、表达、分离纯化及其生物学活性研究 1、ICOS的基因克隆、表达及重组蛋白的纯化 根据文献报道的人ICOS基因序列合成了特异性引物。采用RT-PCR法从活化的人T细胞中扩增了ICOS全长基因，装入T-vector克隆载体。重组质粒T-ICOS经测序确证后，进而PCR扩增ICOS胞外段编码cDNA，即可溶性的ICOS基因片段，并克隆入表达载体pET-28a。构建的重组表达载体pET-ICOS经酶切和序列分析证实后，转化BL-21大肠杆菌，在1-5mmol／L IPTG诱导下，重组蛋白以包涵体方式在BL-21菌株中诱导表达。分离的包涵体经变性、复性和FPLC分离新型共刺激分子工COS/G LSO的研制和生物学特性及运用的研究中文摘要纯化后即获得了较高纯度的ICOS重组蛋白。2、GL50基因克隆、表达及重组蛋白的纯化 根据文献报道的人GL50基因序列合成了特异性引物。采用RT-PCR法从活化的人扁桃体B细胞中扩增了GL50全长基因，装入T-vector。重组质粒下GLSO经测序正确后，经PCR扩增获得了GL50胞外段编码cDNA，即可溶性的GLSO基因片段，并克隆入GsT融合蛋白表达载体pGEX一sx一3。构建的重组表达载体pGEX一5x一3一Lso经酶切和序列分析证实后，转化BL一21大肠杆菌，在0.lmm。比IPTG诱导下，GST-GL50以可溶性方式在BL一21菌株中诱导表达。经离子交换、亲和层析纯化后，获得了较高纯度的GST-GL50重组蛋白。3、ICOSIGL50重组蛋白的体外生物学活性研究 可溶性的GLSO能够促使活化的T细胞分泌IL一10，而可溶性的ICOS具有阻断GL50上调IL一10的作用。鉴此，我们采用体外T细胞激发诱导IL一10产生的实验，观察获得的可溶性GST-GL50和ICOS重组蛋白的生物学活性。我们的研究表明，活化的CD4+T细胞中加入GST-GL50重组蛋白即可显著上调T细胞对IL一10的表达;加入ICOS重组蛋白，则能拮抗GST-GL50的对IL一10的上调作用。由此说明我们制备的ICOS/G L50重组蛋白具有良好的生物学功能。我们的研究还发现，IL一2和CD28激发性抗体能进一步促进GL50一ICOS对IL一10的上调作用，而加入 IL一2中和抗体能阻断上述作用。此结果提示，B7一CD28/C TLA一4信号可对GL50一ICOS产生调节作用。二、IeOS/GL5o转基因L929细胞的构建及其应用1、ICOS转基因L929细胞 合成全长ICOS(包括引导肤序列)特异性引物，引物中分别引入BamHI与EcoRI酶切位点，以T-ICOS质粒为模板进行PCR反应。PCR产物经刀口用Hl与EcoRI双酶切后装入逆转录病毒表达载体pEG刀HA一Te肋，测序正确的重组表达载体pEGz一IC0s与辅助病毒载体p班T60和pHrr456混合后，脂质体法转染包装细胞293T细胞，以获得具有感染能力的重组逆转录病毒，后者再感染L929细胞于6孔板中，在Zeocin加压筛选获得抗性转基因细胞的基础上，采用免疫荧光标记和流式细胞仪分选，即获得了高表达ICOS的转基因L929细胞。2、GL50转基因L929细胞的构建新型共刺激分子IcoS/GL50的研制和生物学特性及运用的研究中文摘要 PCR扩增全长的GL50cDNA(含引导肤序列和起始密码子ArG)，Ncol与EcoRI双酶切后装入PcDNA3 .1载体，经鉴定正确的重组表达质粒DNA (peDNA3一GL50)脂质体法转染L929细胞。在Zeocin加压筛选获得抗性转基因细胞的基础上，采用免疫荧光标记和流式细胞仪分选，即获得了高表达GLS.0的转基因L929细胞。3、ICOS转基因细胞在T细胞依赖性B细胞应答中的作用 在PWM驱动的B细胞培养体系中，与对照L929细胞相比，ICOS转基因细胞与CD40L转基因细胞单独均不能促进B细胞对IgG的分泌。这提示GL50八COS信号转导与CD40IJCD40一样，单独对B细胞分泌抗体没有显著的影响。然而，在B细胞培养的第4天，通过细胞计数发现，与对照L929细胞相比，加入ICOS转基因细胞能使B淋巴细胞的数量明显增多。在体外培养体系中，ICOS转基因细胞能显著促进IL一10对B细胞分泌lgG的上调作用。以上结果表明，ICOS一GL50信号能促进B细胞的增殖。必须注意的是，由于ICOS一GL50信号能上调IL一10和IL一4的表达，而IL一10和IL一4能促进B细胞分泌IgG，所以在体内环境下，ICOS一GL50信号不仅能促进B细胞的增殖，也可能上调IgG水平。?