论文部分内容阅读
癫痫(Epilepsy)是以大脑神经元突发性异常放电为主要特征的神经类疾病。经过正规抗癫痫药物治疗后,仍有约25%患者为药物难治性癫痫。解析癫痫发生的病因及寻找癫痫的药物新靶标仍是重要研究方向。脑血管因素在癫痫中扮演重要角色,但关于血管内皮源性危险因素是否参与或导致癫痫发病却少有报道。Cdk5是脯氨酸导向的丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员之一,其主要分布于神经系统中,也表达于血细胞,血管内皮细胞,肿瘤细胞,上皮细胞,睾丸,脂肪组织,内分泌组织等部位。其中神经元中的Cdk5主要功能有参与神经元的迁移和分化,轴突的生长和突触的发生等。细胞实验表明,Cdk5主要参与内皮细胞的迁移、增殖、炎症激活和衰老等,但在体实验相关资料仍相当缺乏。本研究通过在体条件敲除小鼠内皮细胞Cdk5观察到自发性癫痫的发生,并通过神经生化、电生理记录及药理学调控等技术手段阐释其发作、发生机制。本课题的主要研究内容具体如下:1.血管内皮细胞Cdk5条件敲除小鼠的构建及行为学表型研究目的:利用Cre/loxP系统构建内皮条件敲除Cdk5的Cdh5Cre;Cdk5f/f小鼠,进行行为学实验确定其表型并加以验证。方法和结果:将Cdh5Cre小鼠与Cdk5f/f杂交得到Cdh5Cre;Cdk5f/n,再将Cdh5Cre;Cdk5f/n杂交得到Cdh5Cre;Cdk5f/f小鼠。通过PCR-琼脂糖凝胶电泳进行基因鉴定。Cdh5Cre;Cdk5f/f小鼠与对照组一起,进行4周,12周各种行为学实验,包括旷场、Y迷宫、新事物认知、高架O迷宫、悬尾、强迫游泳、24h自主活动等。在偶然发现癫痫发作后,我们开展了 4周、8周、16周、24周癫痫发作视频监控,统计癫痫发作概率和每天发作频率。进行PET实验确定癫痫病灶部位,EEG监测进一步对癫痫表型进行确认。在实验中发现,4周和12周敲除动物在旷场中的移动距离和速度显著升高,此与动物对新环境的反应性不同相关。悬尾实验两组动物快动时间无差异可以排除狂躁症,24 h自主活动可以排除注意力缺陷多动症(attentiondeficithyperactivity disorder,ADHD)。随着时间的推移癫痫发作的概率和每天发作的频率都有升高,EEG显示动物表现即为癫痫。且PET结果表明,癫痫的病灶在海马,此与随着年龄的增长海马相关学习记忆水平下降相一致。结论:首次利用Cre/loxP系统,以血管内皮特异性Cdh5启动子调节Cre重组酶表达,构建了血管内皮特异性Cdk5条件敲除小鼠。经过行为学表型实验和EEG监测确定Cdh5Cre;Cdk5f/f小鼠为一种稳定的新型小鼠自发性癫痫模型。2.血管内皮Cdk5条件敲除小鼠神经元兴奋性和星形胶质细胞变化规律研究目的:用电生理膜片钳和共聚焦免疫荧光手段研究血管内皮细胞Cdk5条件敲除小鼠神经元被动膜特性和突触传递特性以及星形胶质细胞活化的变化规律。方法与结果:检测Cdh5Cre;Cdk5f/f小鼠海马CA1区神经元的被动膜特性、EPSC、IPSC,观察神经元兴奋性的变化,确定是神经元兴奋性突触传递增强,还是抑制性突触传递减弱导致动物癫痫发生。4周,8周,16周胶质细胞原纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)、S100β免疫荧光染色定量研究胶质细胞增殖、活化情况。与对照组比较,Cdh5Cre;Cdk5f/f小鼠海马CA1区动作电位发放显著增加,sEPSC和mEPSC的频率增加但幅度没有变化,而sIPSC和mIPSC的频率和振幅都没有变化。GFAP,S100β免疫荧光染色发现Cdh5Cre;Cdk5f/f小鼠星形胶质细胞进行性地增生、活化。结论:血管内皮Cdk5条件敲除小鼠神经元兴奋性增加,兴奋性突触传递增加但抑制性突触传递未受影响。Cdh5Cre;Cdk5f/f小鼠兴奋性突触传递增加突触前膜神经递质的释放增加无关。推测Cdh5Cre;Cdk5f/f小鼠星形胶质细胞进行性增生、活化病理事件参与介导癫痫发作。3.血管内皮源性Cdk5参与介导癫痫发生的分子机制研究目的:通过检测BBB通透性、星形胶质细胞对谷氨酸及钾离子的再摄取功能,揭示血管内皮条件敲除Cdk5导致癫痫发生的机制。同时,利用转录组组学方法研究敲除Cdk5的原代内皮细胞的基因表达水平的差异,初步探讨血管内皮细胞Cdk5缺失诱发癫痫发生的潜在信号通路。方法与结果:通过注射伊文氏蓝以及荧光成像检测BBB通透性。电生理膜片钳检测18～23天Cdh5Cre;Cdk5f/f小鼠星形胶质细胞Kir4.1电流,GLAST+GLT1介导的电流,GLT1介导的电流。伊文氏蓝荧光成像表明Cdh5Cre;Cdk5f/f小鼠海马腔隙分子层BBB通透性增加。胶质细胞的电生理实验结果表明,敲除后Kir4.1电流减小,但静息膜电位没有变化。Cdh5Cre;Cdk5f/f小鼠GLT1介导的电流均较对照组显著减小。GLT1激活剂头孢曲松可以逆转敲除动物动作电位发放增加和GLT1介导电流的减小和癫痫易感性的增加。转录组组学研究结果表明Cdh5Cre;Cdk5f/f小鼠的内皮细胞之间粘附连接蛋白表达减少并伴有白细胞-内皮细胞关联炎性分子事件激活。结论:初步阐明了血管内皮条件敲除Cdk5导致癫痫发生机制。血管内皮细胞Cdk5缺失可能触发血管内皮细胞间粘附连接蛋白表达减少和白细胞-内皮细胞粘附等炎性分子事件,导致Cdh5Cre;Cdk5f/f小鼠BBB通透性增加,星形胶质细胞Ba2+敏感的Kir4.1电流电导、GLT1谷氨酸转运体功能发生改变,神经元细胞胞外钾离子和谷氨酸缓冲能力受阻,神经元兴奋性增加,从而导致了自发性癫痫的发生。