吴茱萸碱对人胃癌细胞BGC-823、SGC-7901的抗肿瘤作用及其分子机制的研究

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目的:本课题旨在探讨吴茱萸碱(EVO)对人胃癌细胞BGC-823、SGC-7901的增殖抑制并诱导细胞死亡的作用及其可能的作用分子机制。方法:体外培养人胃癌细胞株BGC-823、SGC-7901,经不同浓度(5μM、7.5μM、10μM、12.5μM、15μM)EVO处理24h,48h,72h后,采用CCK-8法检测人胃癌细胞BGC-823、SGC-7901的增殖情况,并计算其IC50值;镜下观察EVO处理24h后胃癌细胞形态学变化;克隆形成实验检测EVO处理24h后对人胃癌细胞克隆集落数量的影响;流式细胞术检测EVO处理24h后对人胃癌细胞周期的影响;凋亡试剂盒检测EVO处理24h后对人胃癌细胞凋亡的影响;CFH-DA试剂盒测定EVO处理24h后细胞内ROS的表达水平,并用NAC(抗氧化剂)处理人胃癌细胞BGC-823、SGC-7901 24h后,检测胃癌细胞增殖活力和细胞凋亡率的变化;Western-blot检测细胞周期相关蛋白和细胞死亡相关蛋白的表达变化并用Z-VAD-fmk(Caspase广谱抑制剂)、Nec-1(RIP1抑制剂)、AG14361和(PARP-1抑制剂)处理人胃癌细胞BGC-823、SGC-7901 24h后,阻断相关蛋白的生物活性,检测胃癌细胞增殖活力和细胞凋亡率的变化,观察是否能逆转EVO诱导的细胞死亡。结果:体外EVO处理24h,48h,72h后,CCK-8结果显示,与DMSO组相比,EVO能显著抑制人胃癌细胞BGC-823、SGC-7901的增殖活性,呈时间-浓度依赖;镜下EVO干预24h后,悬浮细胞增多,胞体缩小、变圆、皱缩,细胞活力显著降低,并能降低人胃癌细胞BGC-823、SGC-7901的克隆集落数(p<0.01);FCM分析显示,10μM EVO处理24h后,EVO主要阻滞细胞于G2/M期(p<0.001),并诱导BGC-823、SGC-7901细胞发生凋亡,并且主要以晚期凋亡为主(p<0.01);EVO能诱导胞内产生了大量的ROS,而NAC处理24h后,NAC几乎完全阻断了EVO诱导的细胞增殖活力抑制和细胞死亡,暗示EVO诱导的细胞死亡依赖于ROS的表达水平;Western-blot结果显示,EVO能下调细胞周期促进蛋白Cdc25C的表达,促进细胞周期抑制蛋白p53的表达,并上调周期素CyclinB1/Cdc2的蛋白表达水平。同时,EVO能增加细胞凋亡相关蛋白Caspase-3/9和PARP-1的裂解,诱导细胞凋亡;又能活化Caspase-8和c-FLIP,增加RIP1和RIP3磷酸化水平,但对Bcl-2/Bax比值并没有明显影响,这表明EVO能启动外源性细胞凋亡和程序性细胞坏死途径,诱导胃癌细胞死亡,并呈时间依赖性。然而,抑制剂Z-VAD-fmk、Nec-1和AG14361处理24h后,未能逆转EVO诱导的细胞死亡,这说明EVO诱导胃癌细胞死亡类型和作用机制的复杂性和不可逆转性。结论:综上所述,EVO能显著抑制胃癌细胞的增殖,呈时间-浓度依赖性;EVO能显著诱导胃癌细胞周期G2/M期阻滞和细胞死亡,抑制胃癌细胞增殖,其作用机制可能与EVO通过ROS依赖性途径诱导胃癌细胞外源性细胞凋亡和程序性细胞坏死有关。
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