AVM致体外培养王鸽脑神经细胞凋亡机理的研究

来源 :东北农业大学 | 被引量 : 13次 | 上传用户:mailyangli
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阿维菌素(AVM)具有优异的驱虫活性和安全性,是目前广泛使用的畜禽体内外抗寄生虫药物,也是农业上广泛使用的高效杀虫剂。AVM在环境中的残留已经影响到环境的生态系统。虽然对AVM的毒性已有了大量研究,但有关AVM对体外培养细胞毒性的研究还很少。本课题以体外培养王鸽脑神经细胞为研究对象,在培养体系中加10μg·L-1AVM,应用流式细胞术、原位末端标记、DNA电泳分析、荧光染色、电子显微镜等方法,从细胞超微结构、细胞内游离Ca2+浓度、染色体DNA损伤、线粒体膜电位(△ψm)及Caspase-3活性等方面,研究AVM诱导王鸽脑神经细胞凋亡的形态学改变、生物化学改变及可能的调控环节,旨在探讨AVM诱导神经细胞损伤的发生机理,为合理应用AVM药物和保护生态环境提供科学依据。主要结果如下:1.选用7~8日龄鸽胚分离脑神经细胞,在培养体系中加入2μg·ml-1阿糖胞苷可以获得稳定纯化率较高的神经细胞。采用四唑盐比色法(MTT法)和二硝基苯肼比色法观察AVM对神经细胞活性的影响,结果表明10μg·L-1AVM作用不同时间均可以抑制神经细胞活性,且呈时间依赖性。2.采用Giemsa染色、AO/EB双荧光染色、HE染色、透射电镜观察10μg·L-1AVM诱导神经细胞凋亡情况,从形态学角度证实AVM能够引发神经细胞凋亡。3.应用Fura-2/AM荧光法检测细胞内游离Ca2+浓度,应用琼脂糖凝胶电泳、碱性SCGE、TUNEL法检测AVM对神经细胞DNA的损伤作用,结果证实AVM通过引起神经细胞内游离Ca2+浓度增加,激活内源性核酸内切酶导致DNA在核小体间断裂途径诱导神经细胞凋亡。4.应用流式细胞术检测△ψm,比色法检测Caspase-3活性,研究表明AVM导致神经细胞△ψm下降,Caspase-3活性下降,证实AVM通过激活Caspase通路导致神经细胞凋亡。5.流式细胞术检测磷脂酰丝氨酸(PS),结果表明凋亡的神经细胞PS外翻,证明AVM可使凋亡的神经细胞膜丧失不对称性,细胞膜中的PS由脂膜内侧翻向外侧,可被吞噬细胞识别后导致凋亡细胞的清除。
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