研究背景痴呆目前已经成为一个重要的全球健康问题,随着人口老龄化的日趋凸显,痴呆的发病率呈逐年递增趋势,这个问题的效应预计将在未来被显著放大。临床表现以进行性的认知功能减退,记忆力下降,且伴随行为异常,直至影响其生活自理能力。因此,研究掌握血管性痴呆症的发病机制,最优先考虑的问题应该是预防和治疗。中枢神经系统的损害,无论什么原因,都可能导致认知功能障碍。血管性痴呆是中枢神经系统损害导致痴呆的常见类型之一,是由于脑血管原因如缺血性卒中、出血性卒中导致的脑组织损伤,造成了相应部位神经元损害,影响了脑组织中的病理及生理变化,造成记忆、认知、行为等严重的认知功能障碍综合症。目前认为脑血管病相关认知能力的下降是比以前更常见,是导致神经退行性变的独立危险因素。早期的观点开始在二十世纪初期,认为老年血管性痴呆症是由脑动脉硬化导致的。后在60年代,一些研究人员得出结论,脑梗死体积较大的患者,可能是发展为老年血管性痴呆的巨大危险因素。在70年代,Hachinski等人提出了一个新名词多发脑梗死痴呆,暗含了多次脑梗死后的一个蓄积后果。随着神经影像的快速发展,一些缺血性小血管病变,如白质病变,腔隙性脑梗死,最终可造成认知障碍。血管性痴呆(Vascular dementia, VD)最常见的病理学机制就是脑缺血导致的损害,脑供血可引起大脑缺氧,糖代谢程度降低等情况出现,随着病程的进展,最终可导致痴呆的发生。我国血管性痴呆疾病的患病率大致为1.1-1.3%的水平,年发病率处于5-9‰,并且随着国人生活改善,生活行为方式的转变以及社会环境及工作压力的增加,呈现出逐年上升的态势。VD不仅会影响病人的自我调节能力,同时也大大降低了生活质量,会令病人的家庭出现较大的经济困难,甚至造成了沉重的社会经济负担,所以血管性痴呆的预防和治疗的研究领域较为重要,也是热点领域,这也就促使其成为我国当前急需重视和解决的社会和医学问题。肉苁蓉(Cistanche deserticola Ma)是寄生在沙漠中树木梭梭根部的一种寄生植物,从梭梭中吸取所需的营养成份及水。素有人间“沙漠人参”的美誉,具有极高的药理学价值,是中国名贵的传统中药材。已有相关研究证明其具有抗衰老作用,调整内分泌系统功能、促进机体代谢,增强免疫系统的免疫能力,保护肝脏、心脏及脑血管系统。本实验所用成分为肉苁蓉总苷,是从肉苁蓉中提取而得,被广泛用来作为一种具有神经保护作用的中药成分,采用现代药理学的相关研究方法,多项研究表明肉苁蓉总苷可以防止小脑颗粒神经元凋亡,抑制caspase-3和caspase-8的活动而发挥其抗凋亡的影响。肉苁蓉提取物通过增加神经细胞分化,轴突长度和突触的形成来改善小鼠学习记忆[3]。但肉苁蓉总苷对脑缺血后海马神经元的研究及对认知功能的影响却少有报道,特别是对脑缺血后海马神经元蛋白组学的构成的研究国内外均未见报道。本研究采用2-VO方法致局灶性脑缺血诱发VD大鼠模型,并使用肉苁蓉总苷对模型进行干预治疗,通过行为性研究、蛋白组学技术及免疫组化等方法,为深入探讨VD发病过程中可能的关键机制,及其防治新措施提供了实验依据。第一部分血管性痴呆大鼠模型制备及肉苁蓉对血管性痴呆大鼠模型行为学的影响VD是建立在脑血管病的基础上,以记忆力、行为、认知等功能缺损为主。最常见的病理学机制就是脑缺血导致的损害,是老年痴呆中仅次于阿尔茨海默氏病的第二种常见类型。脑缺血可引起大脑缺氧,糖代谢程度降低等情况出现。海马是学习记忆的高级活动中枢,对脑组织缺血、缺氧等损伤很敏感。本实验采用2-VO大鼠模型,结扎Wistar大鼠双侧颈总动脉,这种模型制作简单,且稳定,是国内外公认的研究血管性痴呆的经典动物实验模型。目前治疗血管性痴呆缺乏特效药物,肉苁蓉总苷(glycosides of cistanche,GCs)是从新疆肉苁蓉中提取,主要成分为苯乙醇总苷,对脑缺血、缺氧后脑细胞具有保护作用,本研究选择奥拉西坦作为药物对照组,利用Morris水迷宫实验方法评估肉苁蓉总苷对血管性痴呆模型大鼠学习记忆功能的保护作用。目的：制备大鼠血管性痴呆模型,研究肉苁蓉总苷对血管性痴呆模型大鼠学习记忆功能障碍的改善作用。方法：将Wistar大鼠编号,按照随机数字表顺序,随机分为假手术组、VD模型组、GCs治疗组、奥拉西坦药物对照组,后三组大鼠均用双侧颈总动脉结扎(2-VO法)建立血管性痴呆模型,VD模型组腹腔注射1ml生理盐水,GCs组调整药物浓度为给药量1ml,腹腔注射剂量(10mg/kg/d),奥拉西坦药物对照组调整药物浓度为给药量1ml,腹腔注射剂量(450mg/kg/d),连续用药14天后,用Morris水迷宫实验评价四组大鼠的空间学习记忆功能。结果：(1)Morris水迷宫实验证实VD模型组的大鼠定位航行试验的逃避潜伏期明显延长,与假手术组比较有显著性,具有统计学差异(p<O.O5),从第1天起,VD模型组和假手术组逃避潜伏期差别无统计学意义,随着训练时间延长,第5天VD模型组逃避潜伏期为60.2±18.9s,假手术组则为32.5±9.9s,差异明显增大。并且发现VD模型组随着训练天数的延长,逃避潜伏期也在逐渐缩短,训练第1天逃避潜伏期是82.7±22.3s,第5天逃避潜伏期缩短为60.2±18.9s,可能与大鼠肢体训练有关。(2)肉苁蓉总苷治疗后,第4、5天大鼠逃避潜伏期分别为41.2±20.0s,38.6±15.2s,与VD模型组比较有统计学差异(p<0.05)；肉苁蓉总苷组与奥拉西坦药物对照组及假手术组比较无统计学差异。结论：本实验对各组大鼠经历Morris水迷宫平台逃避潜伏期进行比较,发现从第1天起,VD模型组和假手术组逃避潜伏期差别不明显,根据记录的大鼠的路线图分析,初始各组大鼠搜索平台以随机式或边缘式为主,找到平台的时间需要耗费比较长的时间,随着观察时间延长,第5天VD模型组逃避潜伏期较假手术组差异明显增大。并且发现VD模型组随着训练天数的延长,逃避潜伏期逐渐缩短,可能与大鼠肢体训练及从开始的随机式或边缘式寻找平台,逐渐成为直线式寻找平台有关。在使用肉苁蓉总苷治疗后,大鼠逃避潜伏期较VD模型组明显缩短,提示给予肉苁蓉总苷后大鼠学习记忆能力得到明显改善。第二部分肉苁蓉总苷对血管性痴呆大鼠蛋白组学及免疫组化研究VD是由脑血管疾病引起的,以认知功能损害为主,是老年痴呆的主要类型之一。肉苁蓉总苷从传统医药到现代药理学的研究均证实其能起到神经保护作用tau蛋白是一种微管相关蛋白,主要有促进微管组装,保持微管稳定性及细胞骨架完整性,进一步稳定轴浆运输正常进行。在AD患者的脑组织中发现过度磷酸化的tau蛋白,提示该蛋白导致微管组装能力下降,微管稳定性差,影响突触神经递质的合成、转运、摄取和释放,最终可导致AD患者认知功能下降。蛋白质组学作为新兴学科,系统研究各种生理及病理状态下的蛋白质组成成分构成及活动规律,蛋白组学的出现为从蛋白质的整体水平上去探讨和研究疾病的发生和发展机制和机理提供了一种可能。本文旨在通过磷酸化tau蛋白(p-tau)免疫组化的方法及利用蛋白质组学技术分析各组大鼠p-tau蛋白变化及VD模型海马蛋白质组构成成分及使用肉苁蓉总苷后,VD大鼠海马蛋白质组构成发生的变化,为进一步研究探讨VD可能的致病机制提供依据,也为肉苁蓉总苷从药理角度研究中枢认知功能提供了实验依据。目的：制备大鼠血管性痴呆模型,研究肉苁蓉总苷对血管性痴呆模型大鼠的学习记忆功能障碍的改善作用,从蛋白质组学及p-tau蛋白免疫组化方面探讨其可能的保护机制。方法：将Wistar大鼠编号,随机分为假手术组、VD模型组、GCs治疗组、奥拉西坦药物对照组,后三组大鼠均用双侧颈总动脉结扎(2-VO法)建立血管性痴呆模型,VD模型组腹腔注射1ml生理盐水,GCs组调整药物浓度为给药量1ml,腹腔注射剂量(10mg/kg/d),奥拉西坦药物对照组调整药物浓度为给药量1ml,腹腔注射剂量(450mg/kg/d),连续用药14天后,用Morris水迷宫实验评价四组大鼠的空间学习记忆功能。(同第一部分),完成行为学评估后取出大鼠海马组织,用蛋白组学技术分析VD模型组关键蛋白,以及给予GCs后蛋白质组学变化。并通过免疫组化评估假手术组、VD模型组、GCs治疗组、奥拉西坦药物对照组的tau蛋白磷酸化水平。结果：(1)Morris水迷宫实验证实VD模型组大鼠定位航行试验的逃避潜伏期明显延长；与假手术组比较有显著性差异(p<0.01)。肉苁蓉总苷治疗后,VD大鼠逃避潜伏期缩短；肉苁蓉总苷组与奥拉西坦药物对照组间无统计学差异；(同前一部分)(2)与假手术组比较,VD模型组筛选出21个差异蛋白点,经质谱(mass spectrometry,MS)分析最终鉴定出3个蛋白质表达上调,分别是：硫氧还蛋白样蛋白(thioredoxin-like protein 1 TXL-1),双重特异性丝裂原活化蛋白激酶激酶1(dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1 MAPKK 1),二氢嘧啶酶相关蛋白(Dihydropyrimidinase-related protein 2 Dpysl2),1个蛋白质表达下。调是谷胱甘肽合成酶(glutathione synthetase GCL);与VD模型组比较,从GCs组发现共有15个差异蛋白点,最终鉴定上调蛋白2个,为蛋白热休克蛋白75(heat shock protein 75 kDa Hsp75)和肌动相关蛋白3(actin-related protein 3 Arp3),下调的蛋白1个,为角蛋白,II型细胞骨架6A (keratin, type Ⅱ cytoskeletal 6A)。(3)免疫组化图象定量分析,胞浆呈棕黄色染色为p-tau蛋白,每个标本各个区域随机测量5个视野,每个视野选取5个阳性细胞测量平均灰度值。VD模型组p-tau蛋白水平高于假手术组(P<0.05),使用GCs后,VD模型组p-tau蛋白水平较VD生理盐水组明显下降(P<0.05),与奥拉西坦药物对照组无差别。结论：VD模型组大鼠定位航行试验的逃避潜伏期较假手术组明显延长；表明VD大鼠模型制模成功。肉苁蓉总苷治疗后,大鼠逃避潜伏期缩短；且肉苁蓉总苷组与奥拉西坦药物对照组间无明显差异,表明肉苁蓉总苷对血管性痴呆导致的神经功能损害有保护作用(同前一部分)；经历Morris水迷宫实验的各组大鼠最终取出海马组织,进行蛋白组学分析,发现VD模型组筛选出21个差异蛋白点,经质谱分析最终鉴定出3个蛋白质表达上调,分别是：硫氧还蛋白样蛋白,双重特异性丝裂原活化蛋白激酶激酶1,二氢嘧啶酶相关蛋白,1个蛋白质表达下调是谷胱甘肽合成酶；从肉苁蓉治疗组发现共有15个差异蛋白点,最终鉴定上调蛋白2个,为蛋白热休克蛋白75和肌动相关蛋白3,下调的蛋白1个,为角蛋白,Ⅱ型细胞骨架6A,这些蛋白质功能涉及能量代谢、抗氧自由基、信号转导、神经元极性及轴突形成等多个病理生理过程,为进一步研究探讨VD可能的致病机制提供依据。免疫组化结果提示：VD模型组tau蛋白磷酸化水平(p-tau)较假手术组明显增高,提示与微管蛋白结合程度下降,导致维持微管功能稳定性降低,造成神经纤维退化甚至功能缺失。tau蛋白的过度磷酸化水平可能是血管性痴呆的主要病理改变,肉苁蓉总苷干预后,tau蛋白磷酸化水平明显下降,可改善微管组装活性,从而进一步改善神经递质的合成、转运、摄取和释放。